研究背景和目的:原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在全世界范围内均位居发病率最为普遍的恶性实体肿瘤前列,其在全球范围内的癌症发病率中高居第五,并且其肿瘤导致的相关死亡率在所有肿瘤相关致死率相关统计中高居第三。在许多发展中国家,原发性肝癌往往在晚期才被诊断出来并且此时的切除手术的疗效极其有限。原发性肝癌的发生率在全球范围内具有显著的地理分布及人种差异,并且还具有显著的性别差异存在。相比于白色人种,原发性肝癌的发病率及死亡率在亚洲人尤其的高。为我们所熟知的是,在世界范围内尤其在某些特定地区慢性乙型肝炎病毒(HBV)的感染是密切参与并推进原发性肝癌发生及进一步恶性发展的主要危险因素,在中国,超过80%的肝癌患者均同时伴有乙型肝炎病毒的感染。研究证实,乙型肝炎病毒的基因组DNA可以整合到宿主基因组中并且被认为是乙肝病毒诱发肝癌的主要原因之一。最近有越来越多的研究证据提示乙肝病毒对于宿主基因组的整合作用密切参与肝脏肿瘤的发生。这些乙肝病毒的整合能够诱导宿主基因拷贝数变化(CNV),染色体变化,亦或是宿主基因的表达变化。有研究报道乙型肝炎病毒更为倾向于整合入宿主肿瘤基因组中的热点靶向基因TERT,FAR2,MLL4之中。而与此同时也有其他的研究报道称乙型肝炎病毒往往更倾向于整合入相邻非肿瘤组织基因组的靶向基因FN1和SMAD5之中。.可见之前多篇关于乙肝病毒整合的研究报道之间存在较大的争议,而目前我们也并不知道造成这种差异的内在原因是什么。但是,通过比较我们发现既往相关研究还是存在较大的不足,其研究队列的肝癌样本数目较为有限,同时其检测乙肝病毒整合的技术也不够理想,并且我们认为目前发现的乙型肝炎病毒相关性肝癌关键基因的检测还远远没有系统完成。因此,我们认为针对乙肝病毒整合这个研究方向有必要采取进一步努力和探索,不仅为了确认既往的调查结果,更重要的是,更深入的探索那些重要的乙型肝炎病毒整合易感基因位点。相较于女性,男性患者原发性肝细胞癌的发生率显著更高。最近,大量的研究将重点放在研究性别因素和肝癌发病率以及其临床特征之间的内在关系上。Huang et al报道,乙型肝炎病毒相关的肝癌中男性比女性具有更高的发病风险并且男女患者会显示出不同临床特点。Hou et al报道,原发性肝癌不同的性别差异会使得肿瘤内部在分子水平上也各不相同,最终导致截然不同的分子表型。乙型肝炎病毒整合入人类基因组目前被认为是原发性肝癌癌变过程的一种早期事件。然而,目前没有一项研究报告将重点关注在乙肝病毒整合与性别因素的内在联系上。目前乙型肝炎病毒(HBV)已被鉴定出具有八种基因亚型(A-H)。多个研究小组报告,乙肝病毒不同的基因亚型其感染流行分布有明显的地理差异,并已被证明在临床疗效、患者预后生存及抗病毒治疗反应性等多个方面均存在显著的不同。在亚洲,最流行的乙型肝炎病毒基因亚型是基因亚型B和C。然而,目前没有一项研究报告将重点关注不同乙肝病毒亚型其基因组整合特性的差异。原发性肝癌患者绝大多数均伴有肝脏的肝硬化,但同时也有一部分肝癌患者并不经过长期的肝硬化阶段而直接进展成瘤。在全球,至少三分之一的肝硬化是由于慢性乙型肝炎所致,并且慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的患者中显著一部分最终会进展成为原发性肝癌。大量研究表明肝硬化肝癌和非肝硬化肝癌之间存在着显著的临床和病毒学特征差异。然而,我们发现以往的大多数研究并没有特别区分肝癌患者的肝硬化和非肝硬化情况,此外,肝硬化肝癌和非肝硬化肝癌之间的乙型肝炎病毒整合特性差异目前仍然未知。以往关于乙肝病毒整合的研究多采用southern blot或是传统PCR技术,其技术局限性也很大程度上制约了以往研究的发现,使其无法系统全面的解析宿主基因组中乙肝病毒的整合断点。在乙型肝炎病毒基因组中含有大量的突变,这会导致PCR检测失败。即便使用全基因组测序技术(WGS),乙型肝炎病毒整合断点的检测的灵敏度其实也远远达不到理想的程度。为了解决实际的技术问题,我们的研究参与人员已经开发了一种全新的实验和计算方法,即高通量乙肝病毒整合靶向检测技术(HIVID)。通过实验已经证明,对于识别乙肝病毒整合位点这种全新的靶向检测技术比全基因组测序方法(WGS)更为灵敏。为了解决上述种种关于乙肝病毒整合的科学问题并进一步理解乙肝病毒整合参与肝癌发生发展的具体影响机制,我们系统收集了在我院进行肝癌切除手术的426例病人的配对肿瘤和相邻非肿瘤对照组织,提取其基因组后进行了HIVID的检测。研究入组的426例病毒均经过严格的临床和病理学验证证实其为原发性肝癌肝细胞型。并且我们随机选择12个肿瘤样本进行了转录组测序(RNA seq),以进一步研究其转录水平的变化。本研究旨在探讨乙肝病毒整合在原发性肝癌发生发展中的具体作用及机制,加深我们对于乙肝病毒整合作为肝癌恶性转化及浸润重要作用的了解,为今后乙肝病毒整合研究成果向临床进一步应用转化提供重要的理论依据。实验方法:(1)我们系统了收集426例临床肝癌病人的肝癌及癌旁组织样本进行HIVID检测,以系统全面研究乙肝病毒HBV在肝癌及癌旁组织基因组中的整合特性及其分布。(2)HIVID技术方法验证:通过随机方法挑选出了检测到的60个整合断点进行PCR以及Sanger测序验证。(3)通过肝癌肿瘤及癌旁组织分组进行断点整合谱差异比较。(4)研究全新发现的高频乙肝病毒整合基因转录组水平功能变化:实时定量聚合酶链反应实验(realtime-PCR)。(5)研究全新发现的高频乙肝病毒整合基因蛋白水平功能变化:免疫组化染色实验(IHC)。(6)研究在肿瘤组织中乙肝病毒整合对于其特异性富集信号通路m TOR signaling pathway蛋白水平功能变化:免疫组化染色实验(IHC)。(7)研究肿瘤组织内乙肝病毒整合在转录组水平上的保留及其功能变化:随机挑选了12个含有HBV病毒整合的肿瘤组织进行转录组测序(RNA-seq)实验。(8)研究HBV-DNA在体内的复制与其整合特性内在相关性:HBV-DNA检测试剂COBAS。(9)研究病毒整合的克隆性问题以及验证HIVID检测出的HBV整合断点的可靠性及灵敏性:选取了10个同时具备HIVID及RNA-seq数据的患者的肿瘤组织进行了全基因组测序(WGS)。(10)研究乙肝病毒整合与原发性肝癌临床特征之间的内在相关性及差异:HBV B型VS HBV C型乙肝病毒整合差异,肝硬化肝癌VS非肝硬化肝癌乙肝病毒整合差异,男性患者肝癌VS女性患者肝癌乙肝病毒整合差异。实验结果:(1)在肿瘤组织中一共发现了3486个HBV病毒整合断点,而在对应的癌旁组织中739个HBV病毒整合断点。HBV病毒的总体整合率为76.9%。配对的癌旁对照组织中,HBV病毒的整合率则仅为37.3%。(2)在60个随机挑选的断点中成功验证出52个整合断点存在,并且序列一致,总体验证率为86.7%。(3)HBV病毒在肝癌宿主的肿瘤组织及癌旁组织基因组中的整合分布及整合特性是具有较为显著的差异。在肿瘤组织中,HBV病毒可见高频整合于TERT,KMT2B,CCNE1等一系列基因,在癌旁对照组织中,HBV病毒则高频整合于FN1,PTPRN2及TERT等一系列基因中。(4)在肿瘤组织中,HBV病毒整合靶向基因在m TOR signaling pathway癌症相关通路上有所富集。免疫组化结果进一步证实,HBV病毒的整合可以影响m TOR信号通路在蛋白水平的激活状态。(5)针对肿瘤及癌旁组织中发现全新的高频HBV病毒靶向整合基因包括:PTPRD、UNC5D、NRG3、CTNND2、AHRR,通过IHC及realtime-PCR实验证实,HBV病毒整合可以影响这些靶向基因m RNA及蛋白水平表达。(6)在转录组水平,HBV整合片段在RNA水平在位于1500---1900bp的区域呈现出显著的富集现象,此区域与DNA水平所发现的现象一致。(7)HBV B型及HBV C型乙肝病毒在样本整合率等一系列整合特性上具有显著差异。(8)患者血清中HBV-DNA滴度与其基因组中的发现的整合断点数之间并未发现明显的相关性。(9)单一患者同一瘤体内的多数肝癌细胞均为单克隆起源。多数HBV病毒片段在宿主肝细胞癌细胞中的整合发生在肿瘤形成的早期阶段。(10)男性及女性原发性肝癌患者肿瘤组织中乙肝病毒整合特性上具有显著的性别差异。(11)肝硬化肝癌与非肝硬化肝癌中乙肝病毒整合谱具有显著差异。结论:通过本研究,我们首次采用大样本量队列以及更为灵敏的技术方法系统深入的解析了乙肝相关原发性肝癌肿瘤及癌旁组织中乙肝病毒的整合特性。我们的研究发现,在宿主基因组的基因富集区等特定重要区域以及一部分基因组重要关键位点上,乙肝病毒具有显著的整合偏好性。我们认为,乙肝病毒在宿主基因组上关键位点的整合使得肝细胞具有恶性转化的潜能,密切参与原发性肝癌发生发展的过程。