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目的:STAT1是信号转导与转录激活因子家族的第一个成员,STAT1在宿主防御病毒感染过程中起重要作用。目前STAT1的泛素化修饰在宿主防御病毒感染中的作用及其机制仍然不清楚。本研究主要围绕去泛素化酶BRCC36在天然抗病毒免疫应答中的作用及其机制进行探讨。方法:(1)利用 BRCC36 过表达质粒或 BRCC36 knockdown 质粒或 BRCC36-QSQ(DUB活性缺失的突变体)质粒转染细胞,然后感染VSV-GFP或SeV或CVB3或H1N1病毒,采用倒置荧光显微镜或Realtime qPCR方法或Western Blot方法探究去泛素化酶BRCC36在细胞水平的天然抗病毒免疫应答效应是否依赖于其去泛素化酶活性。(2)利用 BRCC36 过表达质粒或 BRCC36 knockdown 质粒或 BRCC36-QSQ(DUB活性缺失的突变体)质粒转染细胞,采用免疫共沉淀和Western Blot方法探究去泛素化酶BRCC36对STAT1蛋白水平和泛素化水平的影响以及是否依赖于其去泛素化酶活性。(3)利用DUB文库中的66个DUB转染细胞,采用免疫共沉淀和Western Blot方法筛选出与BRCC36和STAT1相互作用的DUB;探究筛选出的DUB对STAT1蛋白水平和泛素化类型的调控;探究E3泛素连接酶Smurf1对STAT1蛋白水平和泛素化类型的调控。(4)Mapping:构建BRCC36不同的缺失突变体,利用这些缺失突变体转染细胞,采用免疫共沉淀和Western Blot方法探究Smurf1和USP13分别与BRCC36哪个区域结合。(5)用SeV病毒感染细胞不同时间点,采用Western Blot方法探究BRCC36和STAT1蛋白表达水平的相关性;以及去泛素化酶BRCC36对病毒感染细胞内STAT1蛋白稳定性的调节。(6)小鼠体内实验:成功构建小鼠Flag-mBRCC3质粒,我们采用HGT高压水流动力学方式通过小鼠尾静脉在小鼠体内注射Flag-mBRCC3过表达质粒,使得小鼠体内高表达mBRCC3蛋白,然后以滴鼻子的方式用VSV-GFP病毒感染小鼠,最后观察小鼠生存曲线;感染后14d收集小鼠肝脏、肾脏和肺,固定于4%福尔马林,然后用HE染色的方法检测小鼠各脏器的病理损伤程度;病毒感染后3d收集小鼠肝脏、肾脏和肺,然后通过Realtime qPCR方法检测小鼠各组织脏器中VSV病毒载量。为了探究mBRCC3在小鼠体内天然抗病毒免疫应答是否依赖于STAT1,我们用STAT1的活性抑制剂Fludarabine处理对照组小鼠和Flag-mBRCC3组小鼠体内分离出来的肝细胞,然后感染VSV-GFP病毒,采用Realtime qPCR方法检测肝细胞内VSV病毒载量。结果:(1)倒置荧光显微镜或Realtime qPCR或Western Blot结果均显示:去泛素化酶BRCC36促进天然抗病毒免疫应答,并且不依赖于其去泛素化酶活性。(2)去泛素化酶BRCC36与STAT1相互作用,上调STAT1蛋白水平并促进STAT1蛋白稳定性;去泛素化酶BRCC36去STAT1的泛素化不依赖于其去泛素化酶活性,其调控STAT1的泛素化类型是K63位泛素。(3)采用免疫共沉淀和Western Blot方法从DUB文库中筛选出与BRCC36和STAT1相互作用的去泛素化酶USP13;去泛素化酶USP13上调STAT1蛋白,其调控STAT1泛素化类型是K48位和K63位泛素。E3泛素连接酶Smurf1降解STAT1蛋白,其泛素化STAT1的类型是K48位泛素。(4)Mapping结果显示:去泛素化酶USP13是结合到BRCC36蛋白的N端,而E3泛素连接酶Smurfl是结合到BRCC36蛋白的C端,二者分别结合到BRCC36蛋白不同的区域。(5)SeV病毒感染细胞时,细胞内BRCC36蛋白和STAT1蛋白之间存在一定的正相关性;去泛素化酶BRCC36促进病毒感染时细胞内STAT1蛋白稳定性。(6)成功构建并表达小鼠Flag-mBRCC3质粒;HGT高压水流动力学方式注射的Flag-mBRCC3质粒在小鼠肝脏和肾脏中表达较高,而在肺组织中几乎没有表达;Flag-mBRCC3促进小鼠体内STAT1介导的天然抗病毒免疫应答,显著延长病毒感染引起的小鼠的存活率;Flag-mBRCC3明显改善病毒感染引起的小鼠肝脏和肾脏的病理损伤程度,而不影响肺组织的病理损伤程度;Flag-mBRCC3显著抑制小鼠肝脏和肾脏中VSV-GFP病毒载量,而不影响肺组织中的VSV-GFP病毒载量。Fludarabine是STAT1的活性抑制剂,Flag-mBRCC3可以显著抑制小鼠肝细胞中的VSV-GFP病毒载量,而在抑制STAT1活性的情况下,Flag-mBRCC3不能抑制VSV-GFP病毒载量。结论:去泛素化酶BRCC36通过平衡去泛素化酶USP13和E3泛素连接酶Smurf1对STAT1的泛素化调节,进而稳定STAT1蛋白水平,最终促进了天然抗病毒免疫应答。