研究背景癫痫是大脑神经元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病，其中生后第一年的发病率最高。近年来关于癫痫患者伴有认知损害的报道越来越多，多数学者的研究认为认知损害与抗癫痫药的副作用有关。抗癫痫药(AEDs)是目前用来预防和治疗癫痫发作的主要手段，其作用机制大致分为三种：(1)作用于电压依赖性钠通道限制持续重复的神经元放电；(2)增强γ-氨基丁酸(GABA)的抑制功能；(3)抑制兴奋性谷氨酸神经递质。临床上早就注意到AEDs对认知的损害，近年来多种新型AEDs研发并上市，人们对于新型AEDs的兴趣越来越浓，是因为新型AEDs不仅可以用于癫痫治疗，还可以用于偏头痛的预防、神经病性疼痛综合征和神经保护。但是关于新型AEDs对发育期大脑认知功能影响的研究还较少，有一些研究显示新型AEDs如托吡酯、加巴喷丁、拉莫三嗪较传统AEDs对认知的影响小。因此本研究中除了传统的AEDs还选用了常用的新型AEDs，并采用不同的测试方法观察了不同药物不同剂量时对幼鼠活动水平及学习记忆各方面的影响，这将帮助我们比较不同AEDs可能对认知造成的损害。AEDs有多种副作用，包括胎儿畸形、发育延迟和头小畸形等，而对认知功能的损害则是对生活质量影响较严重的副作用，但是其具体的机制尚不明了。有报道说AEDs会引起大脑细胞凋亡的增加，可能是引起认知损害的原因。但是关于其他的可能机制如AEDs对神经元前体细胞的增殖和迁移的影响、对突触形成的干扰等方面的研究还是空白，目前尚未见到关于这方面研究的论文报道，而这些方面也有可能是造成人类生前或生后接触AEDs引起认知功能损害的重要原因。因此，本研究观察了AEDs对细胞凋亡、神经营养物质、神经发生和苔藓纤维发芽等各方面的影响，试图解释AEDs影响认知功能的机制。近年来随着对癫痫动物模型研究的深入，越来越多的证据表明环境因素对于多种脑损伤造成的认知损害均有改善作用，包括外伤或结构破坏引起的动物的记忆水平和运动技能的损害，局部脑缺血造成的缺血性损伤，此外丰富环境(enriched environment EE)对于胎儿宫内接触酒精损害和老化造成的认知损害也有改善作用。但是多数研究都集中在癫痫动物模型中，丰富环境对于AEDs引起的认知损害有怎样的作用仍不明了。因此本实验同时探讨了丰富的环境对于长期使用苯巴比妥(PB)和丙戊酸(VPA)的大鼠认知功能损害的改善作用。此前的试验多集中在成年期，对于发育期大脑的研究并不多见，而新生儿的神经解剖及生理与成人有很大不同，如神经突起生长、突触产生及发育尚未完成，未成熟海马及皮层神经元对惊厥活动更易感，黑质惊厥抑制系统发育不足，电惊厥传播异常等，从而推测发育期大脑对AEDs的反应与成人也不尽相同，并且在临床上癫痫的治疗需要数年甚至需要终身服药。因此有必要对长期应用抗癫痫药对幼鼠认知的影响及其机制进行深入的研究并对认知功能损害的防治进行初步探讨。目的研究长期应用AEDs对幼鼠活动水平、空间学习记忆及工作记忆的影响，并探讨了长期使用AEDs后对神经发生，细胞凋亡及神经营养物质等的影响，从而在细胞及分子水平上探讨AEDs影响认知功能的机制。并初步探讨了丰富环境对AEDs所造成的认知损害的改善作用。方法1．长期应用AEDs对幼鼠认知的影响：将生后7天(P7)的Wistar大鼠随机分为药物组72只，对照组12只。药物组大鼠又分为4组分别接受以下药物剂量：苯巴比妥(PB)(20，40，or 80 mg／kg，腹腔注射)，丙戊酸钠(VPA)(50，100，or 200 mg／kg，腹腔注射)，拉莫三嗪(LTG)(20，40，or 80 mg／kg，灌胃)，托吡酯(TPM)(20，40，or 80 mg／kg，灌胃)。对照组大鼠一半(n=6)接受等体积的超纯水腹腔注射，另外一半接受纤维素钠灌胃，连续用药三周。P28时对所有大鼠进行旷场测试以评价其活动水平，P30时大鼠进行Morris水迷宫行为测试评价其视觉—空间学习和记忆能力，P36进行改良的Y迷宫以评价其工作记忆。2．长期应用AEDs对发育期大脑细胞凋亡、神经营养物质及神经发生的影响：将生后7天(P7)的Wistar大鼠随机分为药物组144只，对照组24只，按上述药物种类和剂量分组(n=12)，三周后每组大鼠取6只断头取脑，分别用Annexin-V FITC／PI双标检测细胞凋亡，用实时定量PCR检测脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养物质-3(NT-3)mRNA的表达。其余大鼠及相应对照组过量麻醉后灌注固定分别用于BrdU染色和Timm’s染色，用于BrdU染色的大鼠处死前36h腹腔注射5-溴—2’-脱氧尿核苷(BrdU)(100 mg／kg，i.p.)1次。3．丰富环境对改善AEDs造成的认知损害的作用：将生后7天(P7)的Wistar大鼠随机分为药物组36只，药物+EE组36只。药物组和药物+EE组大鼠接受以下药物：PB(20，40，or 80 mg／kg，i.p.)，VPA(50，100，or 200 mg／kg，i.p.)，连续用药三周。药物+EE组大鼠饲养于丰富环境每天6小时(丰富环境是由一个长115厘米，宽40厘米，高40厘米的矩形容器构成，顶端由塑料顶盖盖住；由一些玩具产生触觉和视觉的刺激，有一个踏车和几个可以躲避的地方，还有像钟表一样可以移动的东西，钟表带有彩色的钟摆和一面镜子；听觉刺激由莫扎特钢琴曲产生。每隔三天改变物体摆放的位置)，当动物离开丰富的环境时，其饲养环境与对照组大鼠一样。P28时对所有大鼠进行旷场测试以评价其活动水平，P30时大鼠进行Morris水迷宫行为测试评价其视觉—空间学习和记忆能力，P36进行改良的Y迷宫以评价其工作记忆。结果1．长期应用AEDs对幼鼠认知的影响：各组大鼠均存活，VPA组大鼠体重增长超过对照组(P＜0.05)，LTG组大鼠体重增长较对照组减慢(P＜0.05)，高剂量的TPM组大鼠(80 mg／kg)体重增长也变缓慢(P＜0.05)。在行为学测试中，同一药物组大鼠在不同的测试实验中表现有所差别。在旷场实验中，不同剂量PB组(20，40，or 80 mg／kg)大鼠活动水平均增加(P＜0.05)；VPA组大鼠在较高剂量时(100，or 200 mg／kg)活动水平似乎减少，但没有统计学意义(P＞0.05)；LTG组大鼠在较高剂量时(40，80 mg／kg)活动水平下降(P＜0.05)；而各剂量的TPM组大鼠活动水平均未见明显改变。在Morris水迷宫测试中，不同剂量PB组(20，40，or 80 mg／kg)大鼠找到平台的时间(潜伏期)均延长(P＜0.05)，在目的象限的停留时间较对照组缩短；VPA组大鼠在较高剂量时(100，or 200 mg／kg)潜伏期延长和目的象限的停留时间缩短；LTG组大鼠仅在高剂量时(80 mg／kg)潜伏期有所延长，但在目的象限的停留时间与对照组相比无统计学意义(P＞0.05)；TPM组大鼠较高剂量时(40，or 80 mg／kg)潜伏期延长和目的象限的停留时间缩短(P＜0.05)。在改良的Y迷宫实验中，PB和TPM组大鼠每天前20次尝试或后20次尝试中的后10次尝试，与前10次相比，错误次数(TE)无明显变化(P＞0.05)，无论是训练过程还是保持过程，TE明显高于对照组大鼠(PB组训练F=4.72，P＜0.05；保持F=23.9，P＜0.01；TPM组训练F=4.35，P＜0.05；保持F=15.1，P＜0.01)，说明PB和TPM对大鼠工作记忆产生明显损害。VPA和LTG组大鼠每天前或后20次尝试中的后10次尝试与前10次相比，TE明显减少(P＜0.05)，无论是训练过程还是保持过程，TE与对照组大鼠无明显差别(P＞0.05)，说明VPA和LTG对工作记忆无明显影响。2．长期应用AEDs对发育期大脑细胞凋亡、神经营养物质及神经发生的影响：四种AEDs均会造成幼鼠脑重减轻，80mg／kg的PB导致脑重下降12％(PB组2.03±0.16；对照组2.32±0.24，P＜0.05)，200mg／kg导致重量降低15％(VPA组1.95±0.26，P＜0.01)，LTG 80mg／kg导致脑重减轻6％(LTG组2.16±0.12；对照组2.34±0.21，P＞0.05)，而TPM 80mg／kg导致脑重减轻8％(2.11±0.17，P＜0.05)。四种AEDs均引起神经细胞凋亡的增加，其阈值分别为：PB(20 mg/kg)，VPA(50mg／kg)，LTG(80 mg／kg)and TPM(40mg／kg)。实时定量PCR结果显示海马区BDNF和NT-3mRNA表达的减少，其阈值分别为：PB(40 mg／kg)、VPA(100mg/kg)、LTG(80mg/kg)、TPM(40mg／kg)。此外，VPA(50 mg/kg，212±43，t=3.39 P＜0.01)和LTG(20mg/kg，195±18，t=4.23 P＜0.01)会造成海马齿状回和门区BrdU标记的细胞数增加，但是各剂量的PB(F=0.664，P＞0.05)和TPM(F=0.119，P＞0.05)组大鼠与对照组相比未见明显区别。Timm’s染色结果显示四种AEDs组大鼠与相应对照组相比，CA3区和颗粒细胞上层Timm评分均无统计学意义(P＞0.05)。3．丰富环境对改善AEDs造成的认知损害的作用：在Morris水迷宫行为测试中，PB+EE组大鼠表现优于单纯用药组，但在PB为80mg／kg组没有统计学意义(P＞0.05)，VPA-FEE组大鼠表现优于单纯用药组，100，200mg/kg VPA+EE组大鼠找到平台的潜伏期较VPA组大鼠缩短(P＜0.05)，在目标象限的停留时间比VPA组延长(Man-Whitney U=4.0 P=0.02；Man-Whitney U=5.0 P=0.04)；在Y迷宫测试中，PB+EE组大鼠表现优于单纯用药组，但是80mg／kg的PB+EE组大鼠每天前或后20次尝试中的后10次尝试与前10次相比，TE没有明显差别(P＞0.05)，表明工作记忆的损伤没有恢复。VPA+EE组大鼠表现与单纯用药组无明显差异。环境对于活动水平的改善效果不如对学习记忆的改善明显，只有200mg／kgVPA+EE组大鼠活动水平高于单纯用药组，但是没有统计学意义(P＞0.05)。结论1、传统AEDs在较低剂量时即可对认知的不同方面产生损害，而临床上相对安全的新型AEDs在剂量加大时也会对认知产生影响，但是不同药物对认知损害的程度不同，损害的方向也不同。2、不同AEDs造成大脑细胞凋亡增加和海马区神经营养物质表达减少，其阈值有所不同，这可能是造成认知损害的机制之一。VPA和LTG会造成神经发生增加，但不伴有明显的苔藓纤维发芽，其具体作用有待进一步研究。3、丰富环境可以改善AEDs对认知的损害，但改善的范围有一定限度且改善的程度与用药剂量有关，在PB高剂量时，丰富环境对于认知的改善并不明显。