基于牙本质小管和牙本质无机成分的牙髓干细胞分化与极化研究

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促进牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)分化与极化是组织工程牙再生的重要研究内容。在牙本质再生研究中,DPSCs的分化与极化决定了再生牙本质的组织结构,进而影响再生牙本质发挥机械性能和传导刺激信号等生理功能。目前尚缺乏有效促进DPSCs分化与极化的牙本质再生生物材料。在组织工程研究中,材料的微观形貌在调控种子细胞的生物学行为并影响再生组织的组织结构中发挥重要作用。具有管状微结构的材料因含有开放的通道并能诱导种子细胞生长和分化而被用于再生具有相似结构的组织。牙本质是一种含有密集排列的天然管状结构(牙本质小管)的硬组织,研究其管状结构在生理环境下的功能及其对DPSCs形态和功能的影响,将有望以牙本质为基础形成具有调控种子细胞形态和功能的生物材料,进而对组织工程牙本质再生产生重要意义。鉴于以上,在第二章中我们首先研究了生理环境下的牙本质管状结构在促进修复性牙本质形成中对药物的传导作用。实验将负载携带人BMP2基因的重组腺病毒(AdCMV-hBMP2)明胶海绵置于大鼠磨牙近髓窝洞内,观察牙本质小管传导AdCMV-hBMP2转染牙髓细胞的能力以及促进修复性牙本质形成的作用。结果发现,在转染1天时,AdCMV-EGFP已经成功转染牙髓并表达绿荧光蛋白。而转染3天后,几乎所有牙髓细胞均能表达绿荧光蛋白。组织学观察发现,AdCMV-hBMP2转染牙髓细胞后在原有牙本质基础上形成的修复性牙本质明显多于对照组。而对于露髓的标本,在观察时间范围内,牙髓表面并未形成明显的修复性牙本质。实验结果说明,生理状态下的牙本质小管可以作为一种天然的药物通道,在促进修复性牙本质形成中发挥药物传输作用。牙本质的管状结构和成分可能在修复性牙本质形成中发挥重要的调控作用。为了研究牙本质的三维管状结构和无机成分对DPSCs形态和成牙向分化的影响,在第三章中我们将天然牙本质进行煅烧去除其有机成分,形成了保留牙本质小管结构和无机成分的磷灰石材料(calcined dentin with tubules,CDT),并研究其对DPSCs形态和分化的作用。实验通过扫描电子显微镜、X线衍射分析、X射线能量色散谱分析等方法对CDT进行表征。结果发现,CDT良好保留了天然牙本质小管的结构,小管直径为2.8±0.3μm,其成分主要为羟基磷灰石,是一种亲水性强的管状结构无机材料。MTT结果显示,PBS改性后的CDT生物相容性良好。将DPSCs与含有不同数量牙本质小管的CDT共培养后发现,随牙本质小管数量增加,材料表面的DPSCs倾向由立方状变为梭形。茜素红染色和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)定量分析结果表明,CDT能促进DPSCs形成钙结节和表达ALP。而Real-time PCR结果则显示CDT能促进DPSCs表达牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein-1,DMP1)、ALP和COL1基因。实验结果说明,牙本质的管状结构和无机成分在促进DPSCs形态和功能向成牙本质细胞转变中发挥了重要作用。为进一步使CDT成为能促进DPSCs极化的支架材料,第四章中我们探索了扩大CDT管状结构的方法。通过选择性酸蚀结合超声将CDT的管状结构直径可控扩大,制备了具有不同直径管状结构的牙本质来源无机支架材料(calcined dentin with expanded tubules,CDET)。将CDET与DPSCs共培养后发现,随着CDET管状结构直径的扩大,CDET表面的DPSCs倾向于形成细长的细胞突起,类似成牙本质细胞的形态。扫描电镜和组织学切片观察发现,扩大的管状结构促进了DPSCs突起长入管状结构内。进一步的免疫荧光染色显示,当突起长入微管内后,DPSCs的高尔基体也随之进入管状结构,但细胞核仍停留在材料表面,从而表现出细胞结构的不对称性,即极化状态。Real-time PCR结果发现,当管状结构直径扩大后,CDET表面的DPSCs表达极化相关标记物ECADHERIN和CDC42明显增加。实验结果说明,利用天然牙本质的管状结构和无机成分制备的CDET能在体外促进DPSCs极化。CDET有望成为理想的促进DPSCs极化与分化的生物材料。
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