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肿瘤相关自身抗体是一类具有早期诊断价值的肿瘤标志物,具有高特异性,可能成肝细胞癌早期潜在的标志物之一。本研究从原发性肝癌及非自身免疫性肝病自身抗体检测研究、高通量蛋白芯片筛选进行对肝细胞癌相关自身抗体的探讨评价。第一部分:原发性肝癌及非自身免疫性肝病自身抗体检测研究本部分基于东方肝胆外科医院临床样本数据分析研究,主要采用线性免疫印迹法,对本院2012-2014年非自身免疫性肝炎(Non-autoimmune Hepatitis,NAIH)(75例)、非自身免疫性肝硬化(Non-autoimmune Cirrhosis,NAIC)(118例)、原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)(332例)患者进行临床常用的两大类15项自身抗体(4项抗肝抗原与11项抗可提取核抗原ENA抗体)进行检测,观察阳性率并探索其在PLC中的临床意义。结果显示三组非自身免疫性肝病(Non-autoimmune Liver Disease,NAILD)(肝炎、肝硬化、肝癌)中阳性检出率较高的自身抗体为抗线粒体M2型(AMA-M2)(5.3%、10.2%、6.6%)、抗SSA(4.0%、8.5%、7.2%)、抗着丝粒相关蛋白B(CENP-B)(4.0%、5.9%、3%),但组间无显著差异(P>0.05)。分层分析,HBsAg阴性PLC组抗AMA-M2、抗SSA、抗CENP-B,抗SSB、抗SLA/LP阳性率与HBsAg阳性的PLC组存在显著差异(P<0.05);甲胎蛋白(AFP)阴性(AFP<20ug/L)PLC组中抗CENP-B抗体的阳性率显著高于AFP阳性PLC组(P<0.05);Spearman相关性分析表明PLC患者中,抗AMA-M2、抗CENP-B与AFP负相关;抗AMA-M2与前白蛋白、碱性磷酸酶及血红蛋白呈正相关;抗SSA、抗CENP-B与年龄呈正相关;抗SSA与白蛋白、血红蛋白呈正相关(P<0.05)。多因素回归分析发现,联合抗AMA-M2,抗CENP-B,抗SSA抗体可作为PLC阳性的独立危险因素(OR=2.187,P<0.05,95%CI 1.133-4.222)。本研究证实自身免疫性疾病常用的15种自身抗体在NAIH、NAIC、PLC之间无显著差异。AFP阴性、HBsAg阴性组中的PLC患者自身抗体阳性检出率相对较高。抗AMA-M2,抗CENP-B和抗SSA抗体联合检测,可作为PLC的高危因素,但相关机制有待进一步研究。第二部分:使用高通量蛋白芯片筛选早期肝细胞癌相关自身抗体本部分基于HuProtTM高通量蛋白芯片自身抗体研究,共分为两个阶段,第一个阶段,筛选阶段利用高通量蛋白芯片技术对18例血清样本(9例肝细胞癌混合血清,9例健康人混合血清)进行自身抗体的差异检测筛选,得到70个可能具有潜在诊断价值的自身抗体。研究的第二阶段:本验证阶段共收集72例早期肝细胞癌患者,对照组包括(20例肝硬化患者,20例慢性乙肝患者和20例正常体检者),用以定制高通量蛋白芯片的检测,并以对照组结果的95%百分位数作为截断值,发现共有18个蛋白自身抗体阳性率较高,其中SULT2A1(18.06%)、HN1(16.67%)、AAMP(16.67%)CRCP(15.28%)和ANKRD45(15.28%)大于15%,其他均大于10%。进一步研究分析了两两蛋白自身抗体共同阳性的表达情况,发现抗CRCP及抗SULT2A1两种自身抗体的Kappa系数为0.500,但其他多数自身抗体的Kappa系数在0.24以下。Logistics回归分析得到两项、三项、直到六项组合自身抗体诊断早期肝细胞癌的组合。六项最优组合的约登指数为0.383,其敏感度特异度分别为66.7%和71.6%,即抗CRCP+抗HN1+抗ANKRD45+抗CCDC40+抗VCL+抗AAMP抗体组合。本研究不仅为开辟了早期肝细胞癌相关自身抗体的筛选提供了新信息,而且为自身抗体在早期肝细胞癌的诊断中提供组合应用的提供新思路,为以后自身抗体作为肝癌等肿瘤辅助诊断标志物提供了借鉴。第三部分肝细胞癌相关自身抗体ELISA检测方法建立及应用本部分在以上工作基础上,锁定具有辅助肝细胞癌诊断价值的三个自身抗体分别是抗CRCP抗体、抗GAB1抗体和抗DR1抗体。本研究通过棋盘法对ELISA检测过程的中关键参数进行优化,分别建立相应的ELISA法,并进行临床样本检测,其过程主要包括两个方面,一、各阶段的稀释液类型包括血清稀释、封闭液、酶标二抗稀释液;二、优化间接ELISA方法的各阶段的抗原抗体反应浓度的比例,包括包被蛋白的浓度,稀释血清的比例和酶标二抗的稀释比例。临床样本收集主要来自本院及其他医院的实验诊断科,共204例血清样本,其中肝细胞癌144例,肝硬化20例,慢性乙型肝炎20例,正常人对照20例。通过设定对照组结果的95%百分位数作为截断值,三种抗体的阳性率与对照组比较,分别为9.72%(p>0.05),4.86%(p>0.05,24.31%(p<0.01)。Spearman相关性分析发现抗GAB1抗体和抗CRCP之间存在明显相关性(r=0.377,p<0.001),此外,抗GAB1抗体和抗CRCP抗体与肿瘤大小存在相关性(r=0.229、0.284,p<0.01),三种自身抗体与其他临床指标也存在一定的相关性(未列出),其机制和临床意义有待进一步认识。本研究为肝细胞癌相关自身抗体的ELISA方法建立和应用作出了有意义的探索,基于第二部分选择的三种肝细胞癌相关自身抗体,虽然其诊断价值有限,但仍然了发现自身抗体为早期癌症诊断标志物的潜在可能性。