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【摘 要】目的：建立高效液相色谱（HPLC）法测定骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的含量。方法：采用HPLC法测定Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：甲醇250 g·L-1∶缓冲液（水∶乙酸∶三乙胺=230∶2.4∶0.3）750 g·L-1；体积流量：1.0 mL·min-1；检测波长254 nm；柱温25 ℃。结果：士的宁在0.120 8～1.449 6 μg线性关系良好，相关系数为0.999 9，士的宁平均回收率为99.01%，RSD为0.91%；马钱子碱在0.094 8～1.137 6 μg线性关系良好，相关系数为1，马钱子碱平均回收率为97.37%，RSD为1.26%。结论：该方法快速、准确、重现性好，可用于骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的质量控制。
【关键词】 马钱子碱；士的宁；骨痹舒片；HPLC
骨痹舒片为河南风湿病医院院内制剂，由制马钱子、制何首乌、桑寄生、黄芪等中药组成。具有补肾壮骨蠲痹、活血通络的功效，用于治疗强直性脊柱炎、类风湿关节炎、骨关节炎等顽痹。方中制马钱子的主要有效成分是士的宁和马钱子碱等生物碱类[1]，同时它们也是毒性成分，均对神经系统、免疫系统及肾脏有毒性作用[2]。二者的治疗剂量和中毒剂量接近。中国药典规定制马钱子治疗剂量为0.3～0.6 g[3]（相当于含士的宁2.3～4.9 mg，
马钱子碱1.5～3.0 mg），士的宁口服中毒剂量成人为5～10 mg，口服致死量为30 mg[1]。为保证临床用药安全有效，有必要对骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的含量进行有效控制[4-5]。因此，本实验研究HPLC法测定士的宁和马钱子碱的含量，并以其为指标控制本品的质量。
1 仪器与药物
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters2489型紫外检测器；士的宁对照品（批号110703-200306）、马钱子碱对照品（110706-200505），均购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。骨痹舒片[河南风湿病医院提供，豫药制字Z20120173（郑），批号：20121202，20130108，20130306]。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇250 g·L-1∶缓冲液（水∶乙酸∶三乙胺= 230∶2.4∶0.3）750 g·L-1[6]；体积流速1.0 mL·min-1；检测波长
254 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。理论板数按士的宁峰计算应不低于5 000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取士的宁对照品、马钱子碱对照品适量，分别用甲醇定容于10 mL
量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品储备液；分别精密量取士的宁对照品溶液1 mL、马钱子碱对照品溶液0.5 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得每1 mL含士的宁0.128 mg、马钱子碱0.094 8 mg的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取骨痹舒20片，除去薄膜衣，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中；精密加入浓氨试液1 mL，氯仿25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率80 W，频率35 kHz）60 min，放冷，再称定重量；用氯仿补足减失重量，精密量取续滤液10 mL置蒸发皿中，水浴蒸干，加甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，摇匀，微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。
2.3 空白对照溶液的制备 按处方制备不含制马钱子药材的阴性样品，按2.2.2项方法制成相应的空白对照溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 专属性考察试验 取对照品溶液、不含制马钱子空白对照溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，分别记录色谱图。结果表明阴性溶液无干扰，该方法专属性较好。见图1。
2.4.2 线性关系考察 精密吸取士的宁和马钱子碱混标对照品溶液1，2，4，6，8，10，12 μL，注入液相色谱仪，测定，以士的宁和马钱子碱的进样体量（μL）为横坐标（X），色谱峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，结果在此范围内均呈良好的线性关系，得士的宁回归方程Y=209 093X-635 98，
r2 =0.999 9，马钱子碱回归方程Y=113 658 X-339 50，
r2 =1。表明士的宁在0.120 8～1.449 6 μg、马钱子碱在0.094 8～1.137 6 μg呈良好的线性关系。
2.4.3 精密度试验 精密量取供试品溶液10 μL，
重复注入液相色谱仪6次，测定，计算得士的宁与马钱子碱峰面积的RSD分别为0.33%，0.74%，表明仪器精密度良好。
2.4.4 稳定性试验 取同一批号供试品溶液分别0，2，4，6，8，12 h，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。计算得士的宁与马钱子碱的RSD值，分别为1.04%，0.88%。表明样品溶液在12 h内稳定。
2.4.5 重复性试验 取同一批号骨痹舒片6份，精密称定，按 2.3项方法制备供试品溶液，按样品含量测定方法测定，结果测得士的宁平均含量为0.72 mg·g-1，RSD值为1.36%；马钱子碱平均含量为0.53 mg·g-1，RSD值为2.43%。
2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的同一批号供试品1 g，精密称定6份，分别加入适量的对照品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，测定。士的宁的平均回收率分别为99.01%，RSD值为0.91%；马钱子碱的平均回收率97.37%，RSD值为1.26%。结果见表1、表2。 2.5 样品含量测定 取3个批次骨痹舒片样品，按2.2.2项下方法操作，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，测定。以外标法计算士的宁和马钱子碱含量，结果见表3。
3 讨 论
实验比较了加热回流提取2 h、浸渍法和超声提取法3种提取方法提取士的宁和马钱子碱的效果，结果三者差异无统计学意义（P > 0.05）。故选择采用操作简单快速的超声提取法。实验中还对超声提取时间分别考察30，60，90，120 min，实验结果表明，供试品用三氯甲烷为溶剂，提取时间为60 min，提取效果较好。
在样品提取过程中，须将样品用适量的浓氨试液润湿，然后再加入氯仿提取。加入浓氨试液后，样品细粉易于粘挂在提取容器壁上，故提取时应缓慢加入提取溶剂；并避免振摇，以免影响测定结果的准确性。
马钱子及其制剂中士的宁、马钱子碱含量测定的HPLC方法已有很多报道，多数在流动相中加入庚烷磺酸钠和磷酸缓冲盐[7-10]，使色谱洗脱步骤繁琐。本实验采用在流动相中加入乙酸和三乙胺，既降低了分析成本，简化了分析步骤，又能实现士的宁、马钱子碱的有效分离。本测定方法灵敏度高，专属性强，重复性好，且空白对照无干扰，能准确有效地测定骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的含量。
4 参考文献
[1] 杨仓良，程方，高渌纹，等.毒剧中药古今用[M].北京：中国医药科技出版社，1991：313-319.
[2] 吴奕富，林久茂，郑良朴.3种不同炮制的马钱子对小鼠血清超氧化物歧化酶和睾酮的影响[J].福建中医学院学报，2004，14（2）：24-25.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].中国医药科技出版社，2010：47-48.
[4] 卫生部药典委员会.中药成方制剂[S].13册.1997.
[5] 傅军，梁基智，梁从庆.马黄酊中马钱子碱和士的宁的HPLC测定[J].中草药，2006，37（5）：711-713.
[6] 李松林，陈邦元.RP-HPLC同时测定马钱子散中士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药学杂志，1998，33（3）：167-169.
[7] 那微，张清波，张淑华，等.HPLC法测定骨筋丸系列品种中马钱子碱和士的宁[J].中成药，2012，34（4）：176-179.
[8] 金日显，郭培华，孔焕宇，等.HPLC法测定郭氏马钱汤中士的宁和马钱子碱的含量[J].中国实验方剂学杂志，2008，14（8）：3-5.
[9] 温晓蓉，谈静.RP-HPLC法测定马钱子胶囊中士的宁与马钱子碱的含量[J].成都中医药大学学报，2008，30（4）：82-84.
[10] 杨春静，郜娜，姬广山.RP-HPLC法测定强筋健骨片中马钱子碱和士的宁的含量[J].中国药师，2010，13（4）：519-520.
【关键词】 马钱子碱；士的宁；骨痹舒片；HPLC
骨痹舒片为河南风湿病医院院内制剂，由制马钱子、制何首乌、桑寄生、黄芪等中药组成。具有补肾壮骨蠲痹、活血通络的功效，用于治疗强直性脊柱炎、类风湿关节炎、骨关节炎等顽痹。方中制马钱子的主要有效成分是士的宁和马钱子碱等生物碱类[1]，同时它们也是毒性成分，均对神经系统、免疫系统及肾脏有毒性作用[2]。二者的治疗剂量和中毒剂量接近。中国药典规定制马钱子治疗剂量为0.3～0.6 g[3]（相当于含士的宁2.3～4.9 mg，
马钱子碱1.5～3.0 mg），士的宁口服中毒剂量成人为5～10 mg，口服致死量为30 mg[1]。为保证临床用药安全有效，有必要对骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的含量进行有效控制[4-5]。因此，本实验研究HPLC法测定士的宁和马钱子碱的含量，并以其为指标控制本品的质量。
1 仪器与药物
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters2489型紫外检测器；士的宁对照品（批号110703-200306）、马钱子碱对照品（110706-200505），均购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。骨痹舒片[河南风湿病医院提供，豫药制字Z20120173（郑），批号：20121202，20130108，20130306]。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇250 g·L-1∶缓冲液（水∶乙酸∶三乙胺= 230∶2.4∶0.3）750 g·L-1[6]；体积流速1.0 mL·min-1；检测波长
254 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。理论板数按士的宁峰计算应不低于5 000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取士的宁对照品、马钱子碱对照品适量，分别用甲醇定容于10 mL
量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品储备液；分别精密量取士的宁对照品溶液1 mL、马钱子碱对照品溶液0.5 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得每1 mL含士的宁0.128 mg、马钱子碱0.094 8 mg的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取骨痹舒20片，除去薄膜衣，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中；精密加入浓氨试液1 mL，氯仿25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率80 W，频率35 kHz）60 min，放冷，再称定重量；用氯仿补足减失重量，精密量取续滤液10 mL置蒸发皿中，水浴蒸干，加甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，摇匀，微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。
2.3 空白对照溶液的制备 按处方制备不含制马钱子药材的阴性样品，按2.2.2项方法制成相应的空白对照溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 专属性考察试验 取对照品溶液、不含制马钱子空白对照溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，分别记录色谱图。结果表明阴性溶液无干扰，该方法专属性较好。见图1。
2.4.2 线性关系考察 精密吸取士的宁和马钱子碱混标对照品溶液1，2，4，6，8，10，12 μL，注入液相色谱仪，测定，以士的宁和马钱子碱的进样体量（μL）为横坐标（X），色谱峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，结果在此范围内均呈良好的线性关系，得士的宁回归方程Y=209 093X-635 98，
r2 =0.999 9，马钱子碱回归方程Y=113 658 X-339 50，
r2 =1。表明士的宁在0.120 8～1.449 6 μg、马钱子碱在0.094 8～1.137 6 μg呈良好的线性关系。
2.4.3 精密度试验 精密量取供试品溶液10 μL，
重复注入液相色谱仪6次，测定，计算得士的宁与马钱子碱峰面积的RSD分别为0.33%，0.74%，表明仪器精密度良好。
2.4.4 稳定性试验 取同一批号供试品溶液分别0，2，4，6，8，12 h，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积。计算得士的宁与马钱子碱的RSD值，分别为1.04%，0.88%。表明样品溶液在12 h内稳定。
2.4.5 重复性试验 取同一批号骨痹舒片6份，精密称定，按 2.3项方法制备供试品溶液，按样品含量测定方法测定，结果测得士的宁平均含量为0.72 mg·g-1，RSD值为1.36%；马钱子碱平均含量为0.53 mg·g-1，RSD值为2.43%。
2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的同一批号供试品1 g，精密称定6份，分别加入适量的对照品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，测定。士的宁的平均回收率分别为99.01%，RSD值为0.91%；马钱子碱的平均回收率97.37%，RSD值为1.26%。结果见表1、表2。 2.5 样品含量测定 取3个批次骨痹舒片样品，按2.2.2项下方法操作，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，测定。以外标法计算士的宁和马钱子碱含量，结果见表3。
3 讨 论
实验比较了加热回流提取2 h、浸渍法和超声提取法3种提取方法提取士的宁和马钱子碱的效果，结果三者差异无统计学意义（P > 0.05）。故选择采用操作简单快速的超声提取法。实验中还对超声提取时间分别考察30，60，90，120 min，实验结果表明，供试品用三氯甲烷为溶剂，提取时间为60 min，提取效果较好。
在样品提取过程中，须将样品用适量的浓氨试液润湿，然后再加入氯仿提取。加入浓氨试液后，样品细粉易于粘挂在提取容器壁上，故提取时应缓慢加入提取溶剂；并避免振摇，以免影响测定结果的准确性。
马钱子及其制剂中士的宁、马钱子碱含量测定的HPLC方法已有很多报道，多数在流动相中加入庚烷磺酸钠和磷酸缓冲盐[7-10]，使色谱洗脱步骤繁琐。本实验采用在流动相中加入乙酸和三乙胺，既降低了分析成本，简化了分析步骤，又能实现士的宁、马钱子碱的有效分离。本测定方法灵敏度高，专属性强，重复性好，且空白对照无干扰，能准确有效地测定骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的含量。
4 参考文献
[1] 杨仓良，程方，高渌纹，等.毒剧中药古今用[M].北京：中国医药科技出版社，1991：313-319.
[2] 吴奕富，林久茂，郑良朴.3种不同炮制的马钱子对小鼠血清超氧化物歧化酶和睾酮的影响[J].福建中医学院学报，2004，14（2）：24-25.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].中国医药科技出版社，2010：47-48.
[4] 卫生部药典委员会.中药成方制剂[S].13册.1997.
[5] 傅军，梁基智，梁从庆.马黄酊中马钱子碱和士的宁的HPLC测定[J].中草药，2006，37（5）：711-713.
[6] 李松林，陈邦元.RP-HPLC同时测定马钱子散中士的宁和马钱子碱的含量[J].中国药学杂志，1998，33（3）：167-169.
[7] 那微，张清波，张淑华，等.HPLC法测定骨筋丸系列品种中马钱子碱和士的宁[J].中成药，2012，34（4）：176-179.
[8] 金日显，郭培华，孔焕宇，等.HPLC法测定郭氏马钱汤中士的宁和马钱子碱的含量[J].中国实验方剂学杂志，2008，14（8）：3-5.
[9] 温晓蓉，谈静.RP-HPLC法测定马钱子胶囊中士的宁与马钱子碱的含量[J].成都中医药大学学报，2008，30（4）：82-84.
[10] 杨春静，郜娜，姬广山.RP-HPLC法测定强筋健骨片中马钱子碱和士的宁的含量[J].中国药师，2010，13（4）：519-520.