本文综合运用单因素和Box-Behnken响应面试验，以山慈菇提取率和其中3种主要化学成分：双[4-（葡萄糖氧）苄基-2-异丁基苹果酸酯-2-葡萄糖苷（dactylorhin A）、双[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）和秋水仙碱的含量为综合权重指标，对其微波提取工艺进行考察。同时，利用高效液相色谱技术建立13批不同产地山慈菇的指纹图谱，明确其主要成分含量分布情况。最后，运用滤纸片扩散法，对制备的山慈菇提取物进行抗菌活性评价。结果表明，山慈菇的最佳微波提取工艺条件为：乙醇浓度55%、料液比1：30 g/mL、提取时间17 min。在此条件下，山慈菇的提取率为12.83%。指纹图谱结果表明，山慈菇中3种化学成分的含量分布趋势一致，其中militarine为13批山慈菇中的共有化学成分，而dactylorhin A和秋水仙碱分别在2个产地样品中未检出，提示不同产地山慈菇中主要化学成分分布具有差异性。抗菌实验结果显示，山慈菇提取物对胶孢炭疽菌、辣椒疫霉菌、灰葡萄孢菌、茄链格孢菌、荧光假单胞菌、水稻白叶枯菌和禾谷镰孢菌没有显示抗菌活性（抑菌圈小于6 mm），对雷尔氏菌具有较好的抑制活性（抑菌圈8.5 mm），表现出一定的抗菌选择性。本研究确定了微波提取山慈菇的最佳工艺，建立的山慈菇中3种成分同步含量分析方法稳定可行，研究结果可为山慈菇药材的质量标准建立和综合开发利用提供参考。