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摘要 [目的]分析细菌型微生物肥料菌群结构。[方法]采用第二代高通量测序技术对细菌型微生物肥料菌群结构进行分析。[结果]产品中测序出的111个OUT具体分属于24个属的细菌，其中共有21个OUT鉴定到种；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）占菌群的主要位置，分别是96.29%和0.66%，其他菌占3.05%；该样品中含有假单胞菌属（Pseudomonas sp.），这提示样品中可能含有植物病原细菌。[结论]将第二代高通量测序技术用于微生物肥料菌群分析，为进出口微生物肥料产品的快速分析提供了一种方法。
关键词 第二代高通量测序；微生物肥料；菌群
中图分类号 S144 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0146-02
Abstract [Objective]To study the bacterial community structure of import microbial fertilizers.[Method]Next generation sequencing technique was used to analyze the bacterial community structure of import microbial fertilizers.[Result] 111 OUTs were identified as 24 genus. Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis accounted for 96.29% and 0.66%， and the other bacteria accounted for 3.05%.Pseudomonas sp. has been found which means plant pathogenic bacteria may contain in this product.[Conclusion]Next generation sequencing technique has been developed for analyzing the bacterial community structure of microbial fertilizers， which can be used for the import or export of microbial fertilizers.
Key words Next generation sequencing technique；Microbial fertilizers；Bacterial community
菌型微生物肥料是一类益生菌制剂产品，它不仅可以促进植物生长，提高产量，而且能够解决因长期施用化肥而造成的一系列生态环境问题，在绿色有机食品生产、农业生态环境保护以及高产、优质、高效农业的持续发展中发挥着重要作用[1-3]。通常而言，细菌型微生物肥料被认为是一个小型的微生物群落，液态微生物菌剂肥料在生产、运输、储存等过程中容易受到杂菌污染，具有携带有毒害或潜在危害的病原菌的风险，施用于农作物上可能引起作物病害，同时人畜食用后会受到病原微生物的威胁。
当进出口微生物肥料产品的批次数量较大时，采用传统分离培养方法工作量太大，因而研发快速、高通量的微生物肥料产品菌群分析技术具有重要意义。目前，微生物肥料群落分析已有少量报道，李朔[4]利用PCR-DGGE指纹图谱技术研究了微生物肥料生产培养过程中菌群的变化；李武等[5]、张晓君等[6]利用PCR-DGGE指纹图谱技术对同一生产批次3个不同包装样品的细菌和真菌群落进行分析，建立了对微生物肥料质量进行评估和检测的方法。但是，这些学者分析的关键点主要集中在微生物肥料生产过程中菌群的变化。另一方面，这些学者采用PCR-DGGE技术进行分析，该技术操作起来非常复杂，耗时耗力。总之，之前的研究不能满足口岸实验室对微生物肥料进行符合性验证快速初筛的要求。
该研究拟采用第二代高通量测序（454测序）技术对进口细菌型微生物肥料进行群落结构分析，旨在建立一套准确分析细菌型微生物肥料菌落结构的技术方案。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用样品为进口液体微生物肥料，自广东汕头国际集装箱码头进口，来源于美国，随机采一个批次的产品作为试验样品（2015年11月进口），该产品标注主要成分为乳杆菌。
1.2 第二代高通量测序法
由中国检验检疫科学研究院进行第二代高通量测序（454测序），具体操作流程如下。
1.2.1 PCR扩增。
对细菌16S rRNA基因的V1～V3区域进行扩增，合成带有5’454 A、B接头-特异引物3’的融合引物。其中通用引物为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；533R：TTACCGCGGCTGCTGGCAC。
PCR扩增条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃复性30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每个样品3个重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物。
1.2.2 油包水PCR （emPCR）。
该过程一般分为4步：DNA片段和捕获磁珠混合；矿物油和水相的剧烈振荡产生油包水环境；DNA片段在油包水环境中扩增；破油并富集有效扩增磁珠。
1.2.3 454测序。
454测序主要步骤如下：PTP板准备和清洗；富集磁珠涂布于PTP板；涂布其他反应成分和包埋磁珠；PTP板置于仪器开始测序。 1.2.4 生物信息分析。
1.2.4.1 数据去杂。对测序端前引物进行错配检查，保留引物的错配数在2个以内的序列；测序时随序列增长碱基质量会降低，检测序列3’端引物和接头，若能检测到且匹配度在95%以上，则认为接头和引物之前的目标区域序列可靠性较高，同时从3’ 端引物处修剪除去尾部序列，对于无法检测到3’端引物和接头的序列，即未测通目标区域的序列，若达到一定长度，则修剪去除末端低质量碱基，从而保留更多的序列信息；去除模糊碱基 （ambiguous） 数大于0、单碱基高重复区 （homologous）大于6以及长度小于200 bp的序列。
1.2.4.2 OTU （Operational Taxonomic Units，操作分类单元） 聚类分析。在97%的相似水平下，应用QIIME软件中Usearch对所有序列进行OTU划分。
1.2.4.3 分类学分析。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，选用Silva （Release115 http：//www.arb-silva.de）数据库进行比对。
1.2.4.4 多样性指数 （Alphadiversity） 计算。在97% （0.97） 的相似水平下，采用Mothur软件（version v.1.30.1 http：//www.mothur. org/wiki/Schloss_ SOPAlpha_ diversity）计算菌群丰度指数（Ace、Chao1）以及菌群多样性指数（Shannon、Simpson指数）。
2 结果与分析
2.1 16S rRNA基因 V1～V3区域扩增结果
对样本基因组DNA进行16S rRNA基因V1～V3区扩增，均得到500 bp左右大小的条带，与目的片段大小一致，且条带单一，可用于后续测序试验 （图1）。
2.2 细菌群落组成分析
该样品共获得116 789条有效序列，有效序列经过进一步去杂和修剪后得到116 751条优化序列，优化序列比例为99.967 4%。经处理共获得111个OUT，Ace指数为163，Chao1指数为175，Shannon指数为0.369，Simpson指数为0.071 9。经比对这111个OUT具体分属于5个门、6个纲、11个目、19个科、24个属的细菌，其中共有21个OUT鉴定到种。按照属级别进行分析，乳杆菌属（Lactobacillus）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、梭菌属（Clostridium）这3个属在菌群中占主要地位，分别占97.72%、0.99%、0.62%，其他细菌占0.67%。按照种级别来进行分析的话，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和短乳杆菌（Lactobacillus brevis）占菌群的主要位置，分别是96.29%和0.66%，其他菌占3.05%。
該样品鉴定出来的乳杆菌属（Lactobacillus）菌株共有7种，分别是Lactobacillus fabifermentans、Lactobacillus faeni、Lactobacillus mobilis、Lactobacillus satsumensis、副干酪乳杆菌亚种Lactobacillus paracasei subsp. paracasei、短乳杆菌Lactobacillus brevis、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，其中植物乳杆菌占主要成分，另外还分析到样品中含有乳球菌属（Lactococcus），这类也经常作为益生菌添加到各类益生菌产品中。相比其他类别菌株，产品中鉴定出的乳杆菌种类是最多的，这与产品标识一致。
该样品中含有假单胞菌属（Pseudomonas sp.），在《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，属于假单胞菌属的检疫性有害生物共有6种，它们分别是菜豆晕疫病菌[Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola （Burkholder） Gardan et al.]、核果树溃疡病菌[Pseudomonas syringae pv. morsprunorum （Wormald ） Young et al.]、桃树溃疡病菌[Pseudomonas syringae pv. persicae （Prunier et al. ） Young et al.]、豌豆细菌性疫病菌[Pseudomonas syringae pv. pisi （Sackett） Young et al.]、十字花科黑斑病菌[Pseudomonas syringae pv. maculicola （McCulloch） Young et al.]、番茄细菌性叶斑病菌[Pseudomonas syringae pv. tomato （Okabe） Young et al.]，这提示人们应该对该产品的这些菌重点关注，另外还有的假单胞菌属的一些菌为食源性病原菌，例如绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa），但值得注意的是，假单胞菌属也有一些有益菌，例如施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）常作为固氮菌添加到微生物肥料产品中，同时也有研究将其用于石油降解应用中。另外，该产品中还含有其他一些可能有害的菌，例如产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）、雷氏普罗威登斯菌（Providencia rettgeri），产气肠杆菌是人类和动物肠道的正常菌群，为人体内的正常菌相，但在人体虚弱的特殊情况下可能会引起疾病；鹑鸡肠球菌是禽类肠道的正常菌群，但其在机体免疫力低下时可入侵血液引发败血症；已有报道称雷氏普罗威登斯菌能引起食物中毒，同时该菌也是一种对虾病原菌。总的来看，这些有害菌在该微生物肥料产品中占的比例很小，造成危害的可能性不大。
3 结论与讨论
该研究采用第二代高通量测序法对一款细菌型微生物肥料产品的菌群进行分析，结果显示植物乳杆菌占该款产品菌群的96.29%，并且可能含有多种潜在危害植物、动物、人类的病原菌，该结果提示人们应该对这款产品的这些类别菌提高关注，值得注意的是，该产品这些有害菌占的比例非常低，风险不大，应针对不同批次产品进行检测，实时监控这些有害菌在不同批次产品中的变化，以综合评估产品风险。
参考文献
[1]王润涵. 国际背景下我国农药使用及行业现状分析和发展趋势研究[D].杭州：浙江大学，2013.
[2]孟瑶， 徐凤花， 孟有庆， 等. 中国微生物肥料研究及应用进展[J]. 中国农学通报， 2008，24（6）：276-283.
[3] 王素英， 陶光灿， 谢光辉， 等. 我国微生物肥料的应用研究进展[J]. 中国农业大学学报， 2003，8（1）：14-18.
[4] 李朔. 利用DGGE法研究微生物肥料培养过程中菌群的变化[D].北京：北京化工大学，2012.
[5] 李武， 王凌华， 赵勇， 等. 分子生态学方法在微生物肥料质量检测中的应用[J]. 微生物学通报， 2006， 33（1）： 53-58.
[6] 张晓君，冯清平.分子生态学方法在微生物多样性研究中的应用[J].微生物学通报，1999，26（1）：68-70.
关键词 第二代高通量测序；微生物肥料；菌群
中图分类号 S144 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0146-02
Abstract [Objective]To study the bacterial community structure of import microbial fertilizers.[Method]Next generation sequencing technique was used to analyze the bacterial community structure of import microbial fertilizers.[Result] 111 OUTs were identified as 24 genus. Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis accounted for 96.29% and 0.66%， and the other bacteria accounted for 3.05%.Pseudomonas sp. has been found which means plant pathogenic bacteria may contain in this product.[Conclusion]Next generation sequencing technique has been developed for analyzing the bacterial community structure of microbial fertilizers， which can be used for the import or export of microbial fertilizers.
Key words Next generation sequencing technique；Microbial fertilizers；Bacterial community
菌型微生物肥料是一类益生菌制剂产品，它不仅可以促进植物生长，提高产量，而且能够解决因长期施用化肥而造成的一系列生态环境问题，在绿色有机食品生产、农业生态环境保护以及高产、优质、高效农业的持续发展中发挥着重要作用[1-3]。通常而言，细菌型微生物肥料被认为是一个小型的微生物群落，液态微生物菌剂肥料在生产、运输、储存等过程中容易受到杂菌污染，具有携带有毒害或潜在危害的病原菌的风险，施用于农作物上可能引起作物病害，同时人畜食用后会受到病原微生物的威胁。
当进出口微生物肥料产品的批次数量较大时，采用传统分离培养方法工作量太大，因而研发快速、高通量的微生物肥料产品菌群分析技术具有重要意义。目前，微生物肥料群落分析已有少量报道，李朔[4]利用PCR-DGGE指纹图谱技术研究了微生物肥料生产培养过程中菌群的变化；李武等[5]、张晓君等[6]利用PCR-DGGE指纹图谱技术对同一生产批次3个不同包装样品的细菌和真菌群落进行分析，建立了对微生物肥料质量进行评估和检测的方法。但是，这些学者分析的关键点主要集中在微生物肥料生产过程中菌群的变化。另一方面，这些学者采用PCR-DGGE技术进行分析，该技术操作起来非常复杂，耗时耗力。总之，之前的研究不能满足口岸实验室对微生物肥料进行符合性验证快速初筛的要求。
该研究拟采用第二代高通量测序（454测序）技术对进口细菌型微生物肥料进行群落结构分析，旨在建立一套准确分析细菌型微生物肥料菌落结构的技术方案。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用样品为进口液体微生物肥料，自广东汕头国际集装箱码头进口，来源于美国，随机采一个批次的产品作为试验样品（2015年11月进口），该产品标注主要成分为乳杆菌。
1.2 第二代高通量测序法
由中国检验检疫科学研究院进行第二代高通量测序（454测序），具体操作流程如下。
1.2.1 PCR扩增。
对细菌16S rRNA基因的V1～V3区域进行扩增，合成带有5’454 A、B接头-特异引物3’的融合引物。其中通用引物为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；533R：TTACCGCGGCTGCTGGCAC。
PCR扩增条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃复性30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每个样品3个重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物。
1.2.2 油包水PCR （emPCR）。
该过程一般分为4步：DNA片段和捕获磁珠混合；矿物油和水相的剧烈振荡产生油包水环境；DNA片段在油包水环境中扩增；破油并富集有效扩增磁珠。
1.2.3 454测序。
454测序主要步骤如下：PTP板准备和清洗；富集磁珠涂布于PTP板；涂布其他反应成分和包埋磁珠；PTP板置于仪器开始测序。 1.2.4 生物信息分析。
1.2.4.1 数据去杂。对测序端前引物进行错配检查，保留引物的错配数在2个以内的序列；测序时随序列增长碱基质量会降低，检测序列3’端引物和接头，若能检测到且匹配度在95%以上，则认为接头和引物之前的目标区域序列可靠性较高，同时从3’ 端引物处修剪除去尾部序列，对于无法检测到3’端引物和接头的序列，即未测通目标区域的序列，若达到一定长度，则修剪去除末端低质量碱基，从而保留更多的序列信息；去除模糊碱基 （ambiguous） 数大于0、单碱基高重复区 （homologous）大于6以及长度小于200 bp的序列。
1.2.4.2 OTU （Operational Taxonomic Units，操作分类单元） 聚类分析。在97%的相似水平下，应用QIIME软件中Usearch对所有序列进行OTU划分。
1.2.4.3 分类学分析。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，选用Silva （Release115 http：//www.arb-silva.de）数据库进行比对。
1.2.4.4 多样性指数 （Alphadiversity） 计算。在97% （0.97） 的相似水平下，采用Mothur软件（version v.1.30.1 http：//www.mothur. org/wiki/Schloss_ SOPAlpha_ diversity）计算菌群丰度指数（Ace、Chao1）以及菌群多样性指数（Shannon、Simpson指数）。
2 结果与分析
2.1 16S rRNA基因 V1～V3区域扩增结果
对样本基因组DNA进行16S rRNA基因V1～V3区扩增，均得到500 bp左右大小的条带，与目的片段大小一致，且条带单一，可用于后续测序试验 （图1）。
2.2 细菌群落组成分析
该样品共获得116 789条有效序列，有效序列经过进一步去杂和修剪后得到116 751条优化序列，优化序列比例为99.967 4%。经处理共获得111个OUT，Ace指数为163，Chao1指数为175，Shannon指数为0.369，Simpson指数为0.071 9。经比对这111个OUT具体分属于5个门、6个纲、11个目、19个科、24个属的细菌，其中共有21个OUT鉴定到种。按照属级别进行分析，乳杆菌属（Lactobacillus）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、梭菌属（Clostridium）这3个属在菌群中占主要地位，分别占97.72%、0.99%、0.62%，其他细菌占0.67%。按照种级别来进行分析的话，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和短乳杆菌（Lactobacillus brevis）占菌群的主要位置，分别是96.29%和0.66%，其他菌占3.05%。
該样品鉴定出来的乳杆菌属（Lactobacillus）菌株共有7种，分别是Lactobacillus fabifermentans、Lactobacillus faeni、Lactobacillus mobilis、Lactobacillus satsumensis、副干酪乳杆菌亚种Lactobacillus paracasei subsp. paracasei、短乳杆菌Lactobacillus brevis、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，其中植物乳杆菌占主要成分，另外还分析到样品中含有乳球菌属（Lactococcus），这类也经常作为益生菌添加到各类益生菌产品中。相比其他类别菌株，产品中鉴定出的乳杆菌种类是最多的，这与产品标识一致。
该样品中含有假单胞菌属（Pseudomonas sp.），在《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，属于假单胞菌属的检疫性有害生物共有6种，它们分别是菜豆晕疫病菌[Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola （Burkholder） Gardan et al.]、核果树溃疡病菌[Pseudomonas syringae pv. morsprunorum （Wormald ） Young et al.]、桃树溃疡病菌[Pseudomonas syringae pv. persicae （Prunier et al. ） Young et al.]、豌豆细菌性疫病菌[Pseudomonas syringae pv. pisi （Sackett） Young et al.]、十字花科黑斑病菌[Pseudomonas syringae pv. maculicola （McCulloch） Young et al.]、番茄细菌性叶斑病菌[Pseudomonas syringae pv. tomato （Okabe） Young et al.]，这提示人们应该对该产品的这些菌重点关注，另外还有的假单胞菌属的一些菌为食源性病原菌，例如绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa），但值得注意的是，假单胞菌属也有一些有益菌，例如施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）常作为固氮菌添加到微生物肥料产品中，同时也有研究将其用于石油降解应用中。另外，该产品中还含有其他一些可能有害的菌，例如产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）、雷氏普罗威登斯菌（Providencia rettgeri），产气肠杆菌是人类和动物肠道的正常菌群，为人体内的正常菌相，但在人体虚弱的特殊情况下可能会引起疾病；鹑鸡肠球菌是禽类肠道的正常菌群，但其在机体免疫力低下时可入侵血液引发败血症；已有报道称雷氏普罗威登斯菌能引起食物中毒，同时该菌也是一种对虾病原菌。总的来看，这些有害菌在该微生物肥料产品中占的比例很小，造成危害的可能性不大。
3 结论与讨论
该研究采用第二代高通量测序法对一款细菌型微生物肥料产品的菌群进行分析，结果显示植物乳杆菌占该款产品菌群的96.29%，并且可能含有多种潜在危害植物、动物、人类的病原菌，该结果提示人们应该对这款产品的这些类别菌提高关注，值得注意的是，该产品这些有害菌占的比例非常低，风险不大，应针对不同批次产品进行检测，实时监控这些有害菌在不同批次产品中的变化，以综合评估产品风险。
参考文献
[1]王润涵. 国际背景下我国农药使用及行业现状分析和发展趋势研究[D].杭州：浙江大学，2013.
[2]孟瑶， 徐凤花， 孟有庆， 等. 中国微生物肥料研究及应用进展[J]. 中国农学通报， 2008，24（6）：276-283.
[3] 王素英， 陶光灿， 谢光辉， 等. 我国微生物肥料的应用研究进展[J]. 中国农业大学学报， 2003，8（1）：14-18.
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[5] 李武， 王凌华， 赵勇， 等. 分子生态学方法在微生物肥料质量检测中的应用[J]. 微生物学通报， 2006， 33（1）： 53-58.
[6] 张晓君，冯清平.分子生态学方法在微生物多样性研究中的应用[J].微生物学通报，1999，26（1）：68-70.