【摘 要】
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目的：建立一种在代谢工程改造的毕赤酵母菌中高效敲除靶标蛋白基因的方法。方法：构建敲除载体,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因为靶基因,以尿嘧啶合成关键酶URA3基因
【机 构】
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军事医学科学院生物工程研究所,沈阳药科大学生命科学与生物制药学院
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目的：建立一种在代谢工程改造的毕赤酵母菌中高效敲除靶标蛋白基因的方法。方法：构建敲除载体,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因为靶基因,以尿嘧啶合成关键酶URA3基因为营养缺陷型筛选标记,第一步重组利用ura3正筛选获得敲除载体在酵母染色体中的定点整合,第二步通过5-氟乳清酸（5-FOA）筛选到表型为ura3-的克隆,ura3基因被剔除的同时,目的基因GM-CSF也随之丢失,实现第二次重组;利用基因组PCR和蛋白电泳进行鉴定。结果：通过两步基因同源重组,敲除了毕赤酵母GJK01的报告蛋白GM
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