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【摘要】各种细胞因子在骨折愈合过程中互相影响，互相促进，起着重要的作用，诱导间充质细胞分化为成骨细胞、诱导成骨细胞增殖分化、增加软骨细胞分化加速骨组织形成、促进成纤维细胞增殖分化等。TGF-β、BMP-2、PDGF、G-CSF对促进一般性骨折与骨质疏松性骨折的愈合作用显著.中药促进骨折愈合与促进成骨因子的分泌有密切联系。
【关键词】骨折；骨质疏松；转化生长因子β；骨形态发生蛋白；血小板衍生生长因子；人粒细胞集落刺激因子；中药
【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）19-0094-03
骨折愈合是一个需要细胞与细胞因子协同作用的复杂过程，临床骨折愈合的常见方式[1]分为三个阶段：血肿机化演进期、原始骨痂形成期和骨痂改造塑性期[2]。
多年来研究发现，多种细胞因子在骨折愈合中互相影响，互相促进，起着重要的作用[1-2]。这些作用大致有：诱导间充质细胞分化为成骨细胞、诱导成骨细胞增殖分化、增加软骨细胞分化加速骨组织形成、促进成纤维细胞增殖分化等。而临床和实验研究发现骨质疏松性骨折愈合过程的延长也与一些细胞因子分泌的变化有着重要联系。在骨折的治疗中，中药应用广泛，越来越多的研究证实，中药能促进骨折愈合，且其作用机制与促进成骨相关细胞因子表达有密切联系。
1转化生长因子β
转化生长因子β（ Transforming Growth Factor，TGF-β），在骨中含量较多，由骨细胞产生，在骨折愈合早期即开始表达。能激活成骨细胞的骨生成作用，同时抑制破骨细胞的形成、减少骨吸收。其可以以自分泌或者旁分泌的方式促进成骨，对软骨形成和软骨骨化都起到了重要作用。Zimmerman等[3]发现股骨干和胫骨骨折的患者，在修复手术后14天时，血清中TGF-β1达到高峰。体外研究发现[4]，成软骨细胞和成骨细胞都能生成TGF-β，在软骨骨化过程中也出现大量TGF-β[4]。孙玉鹏等[5]发现在骨折愈合过程中，TGF-β能作用于小鼠股骨干骨膜间充质细胞使之增殖， 分化成软骨细胞和成骨细胞，通过软骨化骨作用形成新的骨质。另外，TGF-β亦可增强重组BMP-2的成骨作用[6]。在骨折愈合早期，TGF-β主要来自于血小板的脱颗粒作用，而PDGF，VEGF，FGF等细胞因子能促新生血管生成，可能能增加TGF-β在损伤部位的表达。几种细胞因子协同作用，共同促进成骨。
Yichayaou等[7]在对老年性髋骨骨折病例的研究中发现，在修复术后7d时，血清中TGF-β1已有明显升高，较高水平可维持一个月。另有实验证明[8]，TGF-β1 在大鼠骨质疏松损伤愈合的过程中存在一种周期性的表达现象：15d时达到高峰30d已经有回落，且TGF-β1的表达水平低于同时期的假手术组。
多个研究发现中药能促进TGF-β等成骨因子分泌而促进骨折愈合。研究发现[9]补肾健脾活血方（淫羊藿、熟地、鹿角霜、申姜、肉苁蓉、败龟板等）中药药液能显著提高骨质疏松骨折大鼠骨折断端TGF-βmRNA的表达水平，可能是中药促进骨质疏松型骨折愈合的机制之一。刘忠伦等[10]在交锁髓内固定术后早、中期用通络消肿汤和续筋接骨胶囊辅助治疗胫骨骨折，发现中药辅助治疗组骨折骨性愈合时间和术后3个月优良率都优于对照组：且中药辅助治疗组的血清TGF-β1水平高于对照组，中药促进骨折骨性愈合的作用机制可能与其促进TGF-β1的表达有关。另有研究发现[11]用丹参接骨胶囊治疗大鼠闭合性股骨骨折，在不同愈合时期TGF-β1表达均高于生理盐水组。
2骨形态发生蛋白
骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP），属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族。在骨发生、骨修复过程中起着不可替代的作用。BMP能诱导特定的间充质细胞转化为成骨细胞[12]，并可以以软骨内化骨和膜内化骨两种方式诱导成骨。BMPs信号通过smad传导，smad家族是一类将信号从细胞膜外传导入细胞膜内的介导者[13]。BMP前体蛋白经蛋白水解后形成活性二聚体，再与BMPRⅠ和 BMPRⅡ型受体的复合物结合，Ⅱ型受体使Ⅰ型受体磷酸化激活，后者通过依次磷酸化Smad-1、Smad-5、Smad-8 来传递BMP信号[14]。
在BMP家族中，现在研究较多的为BMP-2和BMP-7。体外研究发现BMP-2可增强大鼠BMCs向成骨分化的能力[15]。离体的BMP-2可诱导成骨细胞前体细胞分化为较成熟的成骨细胞样细胞[16]。BMP-7单独使用即有很强成骨活性，在富含成骨细胞的细胞培养中，BMP-7能促进细胞增生及胶原合成[17]。体内研究中，Blokhuis[18]等发现，BMP-7能使去势后骨折大鼠骨小梁的数量明显现增加，骨痂体积增大，从而显著促进雌激素缺陷大鼠骨折早期愈合。
刘东宁等[19]通过体外研究发现，三七总皂甙可通过上调BMP-2的表达水平、增强碱性磷酸酶活性，促进骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化。尹宏[20]等用磷酸钙骨水泥-淫羊藿复合物局部治疗大鼠骨质疏松性骨折，发现其BMP-2mRNA的表达高于磷酸钙骨水泥治疗组，提示局部应用淫羊藿复合物治疗能更为有效诱导骨质疏松型骨折局部内源性BMP-2mRNA的表达，从而有效促进骨质疏松型骨折的修复。另有研究发现[21]，接骨Ⅰ号（含红花、桃仁、桂枝、川芎、乳香、没药、元胡、锻自然铜、续断、狗脊等）能提高BMP-7基因表达水平，加速骨折愈合。以上研究均表明中药促进骨折愈合的作用与其促进BMP分泌密切相关。
3血小板衍生生长因子
血小板衍生生长因子（Platelet-Derived Growth Factor，PDGF）广泛存在与骨组织中，为一种促有丝分裂的生长因子。能促进成骨细胞，成纤维细胞等的分裂与增殖，同时也能强力促进间充质细胞的分裂增值，并可通过促进纤维组织生成和血管生成来加速创伤愈合[22]。PDGF是由两条相关多肽链 （A和B）通过二硫键连接而成的二聚体[23]，其存在PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB三种异构体结构。其中PDGF-BB能强烈地促进间充质干细胞的增值和迁移[24-26]。在骨折后组织重建过程中，PDGF-A/B可由成骨细胞、成软骨细胞和间充质干细胞合成分泌，起到募集间充质干细胞聚集于损伤部位，加速骨折愈合的作用[26]。 当骨折发生时， 血小板黏附于骨髓腔内外的毛细血管内皮下层的胶原上， 同时释放大量 PDGF， 能增强单核细胞的大量增殖和分化， 协同其他因子促进骨折愈合[27]。杜志仙等[28]发现脑外伤合并骨折组骨折愈合速度较单纯骨折组快，PDGF于14d达高峰， 维持21d下降，其原因可能为脑外伤后脑组织PDGF表达增强，通过受损的血-脑屏障被运输到血液中， 使血液中的PDGF 浓度升高，从而在骨折部位发生高表达，进而使其调控骨折愈合的作用得以发挥。
在对骨质疏松性骨折愈合影响的研究中[29-30]，发现在骨质疏松性骨折的早期，与PDGF促进一般性骨折机理相同，PDGF可以诱导血管内皮细胞增殖与血管再生， 促进纤维骨痂分化、成熟， 促进成骨细胞分裂、 增殖。
在对促进骨折愈合的中药的机理研究中，魏合伟等[31]发现运用中药骨康（含补骨脂、淫羊藿、熟地等）含药血清培养的成骨细胞进行移植， 能增强骨痂中血小板衍生生长因子A 和血小板衍生生长因子αR 的表达，促进实验性骨质疏松性骨折的愈合。另有对兔骨折的研究发现[32]，接骨丹（含当归、川芎、红花、桃仁、骨碎补、牛膝等）治疗组与对照组比较，治疗组骨折愈合较快，骨折端微循环明显改善，且接骨丹能调节外周血中骨生长因子的合成、分泌，促进BMP、TGF-β、PDGF的表达 。
4人粒细胞集落刺激因子
人粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF）是一种造血生长因子，可以显著增强粒细胞的增殖和分化，增加骨髓前体细胞的数量。另外，它还可以延长中性粒细胞的存活期，使其凋亡延迟[33]。GCSF是骨髓造血干/祖细胞强有力的动员剂， 常应用于骨髓或干细胞移领域，能促进干细胞的释放、富集、动员、迁移和分化 [34]。
在骨折愈合过程中，TGF-β1表达增加，而NSAIDs则能抑制骨折愈合。Kaygusuz MA等[35]研究发现GCSF能使骨折后大鼠TGF-β1表达增加，显著促进骨折愈合。同时给予GCSF后也能拮抗萘普生导致的TGF-β1表达减少以及骨折愈合延迟现象，表明GCSF对促进骨折愈合有显著作用。另有研究表明，rhG-CSF可以在短期内快速动员机体外周造血干细胞增殖和趋化到外周组织损伤处，也可动员外周BMSCs快速增殖。
在相关中药研究中，黄进等[36]研究发现体积分数10%的中药黄精含药血清具有明显促进骨髓间充质干细胞增殖的作用，并显著促进粒细胞集落刺激因子mRNA 的表达。
5小结与展望
近年来，细胞因子的研究可谓是一热点。在骨损伤修复的研究中，研究人员对细胞因子的周期性表达情况、作用机理探讨较多，肯定了其在骨折愈合中发挥的重要作用。但是许多细胞因子家族（如BMP家族）庞大，数量众多，一些目前人们还不熟知、了解还不深入的细胞因子在骨修复中发挥的作用是需要探知的。中药是我国的瑰宝，中药治疗骨折及骨质疏松有广泛的临床应用，探寻中药治疗单纯骨折、骨质疏松、骨质疏松性骨折的分子机理，对中医药发展有着重要意义。
参考文献
[1]Einhorn TA . The cell and molecular biology of fracture healing[J]. Clin Orthop Relat Res，1998，（S355） ：7-21.
[2] 裘法祖.外科学[M].4版.北京：人民卫生出版社， 1995：712-714.
[3] Zimmerman G， Henle P， Kusswetter M， et al. TGF-beta1 as a marker of delayed fracture healing[J]. Bone 2005，36（5）：779-785.
[4] Robey PG， Young MF， Flanders KC，et al. Osteoblasts synthesize and respond to transforming growth factor-in vitro[J]. J Cell Biol， 1987，105（ 7） ： 457-463.
[5] 孙玉鹏，陆裕朴，胡蕴玉，等.TGF-β诱导体内成骨效应[J]. 第四军医大学学报，1997，18（ 2）：129-132.
[6]杜俊杰，胡蕴玉，罗卓荆，等.β转化生长因子增强人重组骨形态发生蛋白 - 2 诱导成骨的调节机理[J].中国矫形外科杂志，1998， 5（ 6）：536-537.
[7] Beloosesky Y， Weiss A， Hershkovitz A， et al. Serum transforming growth factor beta-1 post hip fracture repair in elderly patients[J]. Cytokine，2011，54（1）： 56-60.
[8] 李媛，张瑞，董茵，等，骨质疏松性骨损伤愈合过程中细胞生长因子的动态表达[J]. 天津医药，2009，37 （1）：36-38.
[9] 潘贵超， 王辉奇， 张治国. 补肾健脾活血方对大鼠骨质疏松骨折愈合的作用及其机理探讨 [J]. 中国中医基础医学杂志， 2011， 17（2）： 156-157.
[10]刘忠伦，王昌刚.中药辅助治疗胫腓骨骨折的临床疗效及对转化生长因子-β1表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：270-272.
[11] 王希强，孙仁光，孙仕润，等. 丹参接骨胶囊对闭合性股骨骨折模型大鼠骨折愈合的影响[J]. 中国组织工程研究，2016，20（5）：622-627.
【关键词】骨折；骨质疏松；转化生长因子β；骨形态发生蛋白；血小板衍生生长因子；人粒细胞集落刺激因子；中药
【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）19-0094-03
骨折愈合是一个需要细胞与细胞因子协同作用的复杂过程，临床骨折愈合的常见方式[1]分为三个阶段：血肿机化演进期、原始骨痂形成期和骨痂改造塑性期[2]。
多年来研究发现，多种细胞因子在骨折愈合中互相影响，互相促进，起着重要的作用[1-2]。这些作用大致有：诱导间充质细胞分化为成骨细胞、诱导成骨细胞增殖分化、增加软骨细胞分化加速骨组织形成、促进成纤维细胞增殖分化等。而临床和实验研究发现骨质疏松性骨折愈合过程的延长也与一些细胞因子分泌的变化有着重要联系。在骨折的治疗中，中药应用广泛，越来越多的研究证实，中药能促进骨折愈合，且其作用机制与促进成骨相关细胞因子表达有密切联系。
1转化生长因子β
转化生长因子β（ Transforming Growth Factor，TGF-β），在骨中含量较多，由骨细胞产生，在骨折愈合早期即开始表达。能激活成骨细胞的骨生成作用，同时抑制破骨细胞的形成、减少骨吸收。其可以以自分泌或者旁分泌的方式促进成骨，对软骨形成和软骨骨化都起到了重要作用。Zimmerman等[3]发现股骨干和胫骨骨折的患者，在修复手术后14天时，血清中TGF-β1达到高峰。体外研究发现[4]，成软骨细胞和成骨细胞都能生成TGF-β，在软骨骨化过程中也出现大量TGF-β[4]。孙玉鹏等[5]发现在骨折愈合过程中，TGF-β能作用于小鼠股骨干骨膜间充质细胞使之增殖， 分化成软骨细胞和成骨细胞，通过软骨化骨作用形成新的骨质。另外，TGF-β亦可增强重组BMP-2的成骨作用[6]。在骨折愈合早期，TGF-β主要来自于血小板的脱颗粒作用，而PDGF，VEGF，FGF等细胞因子能促新生血管生成，可能能增加TGF-β在损伤部位的表达。几种细胞因子协同作用，共同促进成骨。
Yichayaou等[7]在对老年性髋骨骨折病例的研究中发现，在修复术后7d时，血清中TGF-β1已有明显升高，较高水平可维持一个月。另有实验证明[8]，TGF-β1 在大鼠骨质疏松损伤愈合的过程中存在一种周期性的表达现象：15d时达到高峰30d已经有回落，且TGF-β1的表达水平低于同时期的假手术组。
多个研究发现中药能促进TGF-β等成骨因子分泌而促进骨折愈合。研究发现[9]补肾健脾活血方（淫羊藿、熟地、鹿角霜、申姜、肉苁蓉、败龟板等）中药药液能显著提高骨质疏松骨折大鼠骨折断端TGF-βmRNA的表达水平，可能是中药促进骨质疏松型骨折愈合的机制之一。刘忠伦等[10]在交锁髓内固定术后早、中期用通络消肿汤和续筋接骨胶囊辅助治疗胫骨骨折，发现中药辅助治疗组骨折骨性愈合时间和术后3个月优良率都优于对照组：且中药辅助治疗组的血清TGF-β1水平高于对照组，中药促进骨折骨性愈合的作用机制可能与其促进TGF-β1的表达有关。另有研究发现[11]用丹参接骨胶囊治疗大鼠闭合性股骨骨折，在不同愈合时期TGF-β1表达均高于生理盐水组。
2骨形态发生蛋白
骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP），属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族。在骨发生、骨修复过程中起着不可替代的作用。BMP能诱导特定的间充质细胞转化为成骨细胞[12]，并可以以软骨内化骨和膜内化骨两种方式诱导成骨。BMPs信号通过smad传导，smad家族是一类将信号从细胞膜外传导入细胞膜内的介导者[13]。BMP前体蛋白经蛋白水解后形成活性二聚体，再与BMPRⅠ和 BMPRⅡ型受体的复合物结合，Ⅱ型受体使Ⅰ型受体磷酸化激活，后者通过依次磷酸化Smad-1、Smad-5、Smad-8 来传递BMP信号[14]。
在BMP家族中，现在研究较多的为BMP-2和BMP-7。体外研究发现BMP-2可增强大鼠BMCs向成骨分化的能力[15]。离体的BMP-2可诱导成骨细胞前体细胞分化为较成熟的成骨细胞样细胞[16]。BMP-7单独使用即有很强成骨活性，在富含成骨细胞的细胞培养中，BMP-7能促进细胞增生及胶原合成[17]。体内研究中，Blokhuis[18]等发现，BMP-7能使去势后骨折大鼠骨小梁的数量明显现增加，骨痂体积增大，从而显著促进雌激素缺陷大鼠骨折早期愈合。
刘东宁等[19]通过体外研究发现，三七总皂甙可通过上调BMP-2的表达水平、增强碱性磷酸酶活性，促进骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化。尹宏[20]等用磷酸钙骨水泥-淫羊藿复合物局部治疗大鼠骨质疏松性骨折，发现其BMP-2mRNA的表达高于磷酸钙骨水泥治疗组，提示局部应用淫羊藿复合物治疗能更为有效诱导骨质疏松型骨折局部内源性BMP-2mRNA的表达，从而有效促进骨质疏松型骨折的修复。另有研究发现[21]，接骨Ⅰ号（含红花、桃仁、桂枝、川芎、乳香、没药、元胡、锻自然铜、续断、狗脊等）能提高BMP-7基因表达水平，加速骨折愈合。以上研究均表明中药促进骨折愈合的作用与其促进BMP分泌密切相关。
3血小板衍生生长因子
血小板衍生生长因子（Platelet-Derived Growth Factor，PDGF）广泛存在与骨组织中，为一种促有丝分裂的生长因子。能促进成骨细胞，成纤维细胞等的分裂与增殖，同时也能强力促进间充质细胞的分裂增值，并可通过促进纤维组织生成和血管生成来加速创伤愈合[22]。PDGF是由两条相关多肽链 （A和B）通过二硫键连接而成的二聚体[23]，其存在PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB三种异构体结构。其中PDGF-BB能强烈地促进间充质干细胞的增值和迁移[24-26]。在骨折后组织重建过程中，PDGF-A/B可由成骨细胞、成软骨细胞和间充质干细胞合成分泌，起到募集间充质干细胞聚集于损伤部位，加速骨折愈合的作用[26]。 当骨折发生时， 血小板黏附于骨髓腔内外的毛细血管内皮下层的胶原上， 同时释放大量 PDGF， 能增强单核细胞的大量增殖和分化， 协同其他因子促进骨折愈合[27]。杜志仙等[28]发现脑外伤合并骨折组骨折愈合速度较单纯骨折组快，PDGF于14d达高峰， 维持21d下降，其原因可能为脑外伤后脑组织PDGF表达增强，通过受损的血-脑屏障被运输到血液中， 使血液中的PDGF 浓度升高，从而在骨折部位发生高表达，进而使其调控骨折愈合的作用得以发挥。
在对骨质疏松性骨折愈合影响的研究中[29-30]，发现在骨质疏松性骨折的早期，与PDGF促进一般性骨折机理相同，PDGF可以诱导血管内皮细胞增殖与血管再生， 促进纤维骨痂分化、成熟， 促进成骨细胞分裂、 增殖。
在对促进骨折愈合的中药的机理研究中，魏合伟等[31]发现运用中药骨康（含补骨脂、淫羊藿、熟地等）含药血清培养的成骨细胞进行移植， 能增强骨痂中血小板衍生生长因子A 和血小板衍生生长因子αR 的表达，促进实验性骨质疏松性骨折的愈合。另有对兔骨折的研究发现[32]，接骨丹（含当归、川芎、红花、桃仁、骨碎补、牛膝等）治疗组与对照组比较，治疗组骨折愈合较快，骨折端微循环明显改善，且接骨丹能调节外周血中骨生长因子的合成、分泌，促进BMP、TGF-β、PDGF的表达 。
4人粒细胞集落刺激因子
人粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor，G-CSF）是一种造血生长因子，可以显著增强粒细胞的增殖和分化，增加骨髓前体细胞的数量。另外，它还可以延长中性粒细胞的存活期，使其凋亡延迟[33]。GCSF是骨髓造血干/祖细胞强有力的动员剂， 常应用于骨髓或干细胞移领域，能促进干细胞的释放、富集、动员、迁移和分化 [34]。
在骨折愈合过程中，TGF-β1表达增加，而NSAIDs则能抑制骨折愈合。Kaygusuz MA等[35]研究发现GCSF能使骨折后大鼠TGF-β1表达增加，显著促进骨折愈合。同时给予GCSF后也能拮抗萘普生导致的TGF-β1表达减少以及骨折愈合延迟现象，表明GCSF对促进骨折愈合有显著作用。另有研究表明，rhG-CSF可以在短期内快速动员机体外周造血干细胞增殖和趋化到外周组织损伤处，也可动员外周BMSCs快速增殖。
在相关中药研究中，黄进等[36]研究发现体积分数10%的中药黄精含药血清具有明显促进骨髓间充质干细胞增殖的作用，并显著促进粒细胞集落刺激因子mRNA 的表达。
5小结与展望
近年来，细胞因子的研究可谓是一热点。在骨损伤修复的研究中，研究人员对细胞因子的周期性表达情况、作用机理探讨较多，肯定了其在骨折愈合中发挥的重要作用。但是许多细胞因子家族（如BMP家族）庞大，数量众多，一些目前人们还不熟知、了解还不深入的细胞因子在骨修复中发挥的作用是需要探知的。中药是我国的瑰宝，中药治疗骨折及骨质疏松有广泛的临床应用，探寻中药治疗单纯骨折、骨质疏松、骨质疏松性骨折的分子机理，对中医药发展有着重要意义。
参考文献
[1]Einhorn TA . The cell and molecular biology of fracture healing[J]. Clin Orthop Relat Res，1998，（S355） ：7-21.
[2] 裘法祖.外科学[M].4版.北京：人民卫生出版社， 1995：712-714.
[3] Zimmerman G， Henle P， Kusswetter M， et al. TGF-beta1 as a marker of delayed fracture healing[J]. Bone 2005，36（5）：779-785.
[4] Robey PG， Young MF， Flanders KC，et al. Osteoblasts synthesize and respond to transforming growth factor-in vitro[J]. J Cell Biol， 1987，105（ 7） ： 457-463.
[5] 孙玉鹏，陆裕朴，胡蕴玉，等.TGF-β诱导体内成骨效应[J]. 第四军医大学学报，1997，18（ 2）：129-132.
[6]杜俊杰，胡蕴玉，罗卓荆，等.β转化生长因子增强人重组骨形态发生蛋白 - 2 诱导成骨的调节机理[J].中国矫形外科杂志，1998， 5（ 6）：536-537.
[7] Beloosesky Y， Weiss A， Hershkovitz A， et al. Serum transforming growth factor beta-1 post hip fracture repair in elderly patients[J]. Cytokine，2011，54（1）： 56-60.
[8] 李媛，张瑞，董茵，等，骨质疏松性骨损伤愈合过程中细胞生长因子的动态表达[J]. 天津医药，2009，37 （1）：36-38.
[9] 潘贵超， 王辉奇， 张治国. 补肾健脾活血方对大鼠骨质疏松骨折愈合的作用及其机理探讨 [J]. 中国中医基础医学杂志， 2011， 17（2）： 156-157.
[10]刘忠伦，王昌刚.中药辅助治疗胫腓骨骨折的临床疗效及对转化生长因子-β1表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：270-272.
[11] 王希强，孙仁光，孙仕润，等. 丹参接骨胶囊对闭合性股骨骨折模型大鼠骨折愈合的影响[J]. 中国组织工程研究，2016，20（5）：622-627.