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摘要：从峨眉山采集异叶天南星（Arisema heterophyllum Blume）健康植株，采用平板涂布法从其根、茎、叶各组织分离纯化内生细菌，采用菌饼平板对峙培养法初步筛选抗甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的菌株，采用牛津杯法进一步筛选抗性菌株。结果表明，可以从峨眉山异叶天南星根、茎、叶各组织中分离得到26株内生细菌；初筛结果显示，26株内生细菌对MRSA均有抗菌活性，其中平均抑菌圈直径超过12 mm的有12株；复筛结果显示，12株拮抗菌抗MRSA活性稳定，与初筛结果无明显差异，菌株YG009、YJ009抗MRSA活性最强，与其他菌株存在极显著差异，有开发抗MRSA新药的潜力。
关键词：异叶天南星；内生细菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；峨眉山；筛选
中图分类号： S567.23 9.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0388-02
异叶天南星（Arisema heterophyllum Blume）为天南星科天南星属多年生草本植物，全国各地均有分布，主要以块茎入药[1]。相关研究结果表明，天南星科药用植物在毒性、刺激性、药用成分、药理活性等很多方面的相似性可以达到80%以上[2]，因此异叶天南星具有与天南星科药用植物相似的功效，且对惊厥等疾病有较好治疗作用[3]。植物的内生菌（endophyte）是指在一定或全部阶段生活在健康植物组织内部的微生物，普遍存在于高等植物中。内生菌由于长期生活在植物组织内部而与植物和谐生长，能够产生与宿主植物所产生的相同或相似的活性化合物[4]。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是临床上常见的1种毒性比较强的细菌[5]，是金黄色葡萄球菌的1种，但能够耐甲氧西林，可引起多种化脓性疾病。MRSA除了对甲氧西林有耐药性外，还对临床上应用的多种抗生素具有耐药性，所导致的感染呈暴发性或散发性流行，治疗极其困难，致死率极高，成为全世界范围内抗感染的难题[6]。从药用植物中筛选出抗MRSA的内生细菌，对于预防和控制由MRSA引起的感染具有重要意义[7]。本研究从采自峨眉山的异叶天南星的根、茎、叶组织中分离内生细菌，采用牛津杯法测定内生细菌对MRSA的抑菌活性，从中筛选抗MRSA活性强的菌株，为抗MRSA新药筛选及峨眉山异叶天南星的保护及开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2013年8月5日从峨眉山万年寺（海拔约800 m）附近采集健康的异叶天南星植株，采集后立即保存于袋内，并迅速带回实验室进行内生细菌的分离。MRSA由峨眉山特色生物资源重点实验室提供。
1.2 内生细菌的分离
分别取健康异叶天南星的根、茎、叶5～10 g，用自来水冲洗表面的泥土等污物后用无菌水冲洗3～5次，再分别用有效氯含量为5%的次氯酸钠消毒2 min、75%乙醇消毒 1 min、01%HgCl消毒5 min，再用无菌水冲洗3～5次后放入无菌搅拌机中打浆，粉碎的组织液置于无菌的三角瓶中备用。分别取最后1次冲洗液和粉碎的组织液各1 mL，稀释10 000倍，涂布于NA平板培养基（蛋白胨0.3%、牛肉膏05%、NaC1 0.5%、葡萄糖0.5%、琼脂1.8%～2.0%、pH值7.0）上，于 28 ℃ 下培养，逐日观察。将挑取的单菌落划线纯化后接种至斜面培养基，28 ℃培养5～7 d，之后于4 ℃保藏菌种。
1.3 异叶天南星拮抗性内生细菌初筛
在NA平板上涂布接种100 μL MRSA培养液，将异叶天南星内生细菌的菌饼（直径7 ㎜）有菌面平整贴在平板表面，28 ℃培养2～3 d后用十字交叉法测量抑菌圈直径，即通过2次十字方位来测量同一抑菌圈的直径，然后再将测得的2次数据求平均值，即为该内生细菌抑菌圈的直径。以无菌的培养基饼（直径7 mm）代替内生细菌接种作为对照，每个处理重复3次。
1.4 异叶天南星拮抗性内生细菌复筛
为了获得抑菌能力较稳定、较强的菌株，将初筛获得的活性菌株纯培养后制成菌悬液。在NA培养基上涂布接种 100 μL MRSA培养液，涂布均匀，每个平板中等距离均匀插入3个牛津杯（直径7 mm），每个牛津杯接种同种活性菌株菌悬液100 μL。28 ℃培养2～3 d后用十字交叉法测量抑菌圈直径。在牛津杯中注入100 μL无菌水代替活性菌株菌悬液接种作为对照，每个处理重复3次。
2 结果与分析
2.1 异叶天南星内生细菌的分离纯化
采用组织液涂布分离方法从异叶天南星健康植株的根、茎、叶中共分离纯化得到26株内生细菌。其中从根中分离出9种菌株，编号依次为YG001-YG009；从茎中分离出11种菌株，编号依次为YJ001-YJ011；从叶中分离出6种菌株，编号依次为YY001-YY006。
2.2 抗MRSA内生细菌初筛结果
将分离纯化得到的26株异叶天南星的内生细菌制成菌饼，然后采用平板对峙法测定内生细菌对MRSA的抑菌活性。结果表明，26株内生细菌对MRSA均有抑菌活性，但各菌株间抑菌活性存在较大差异（表1），其中平均抑菌圈直径超过12 mm的菌株有12种，分别为YG009、YJ009、YJ004、YJ002、YJ006、YJ003、YG001、YG008、YJ011、YJ007、YY003、YY001，選取这12株内生细菌进行复筛。
2.3 抗MRSA内生细菌复筛结果
对初筛中抑菌直径超过12 mm的12株菌株采用牛津杯法复筛，结果表明，12株菌株对MRSA均具有较高的抑菌活性（表2）。其中YG009、YJ009对MRSA的抑菌活性最强，与其他菌株差异极显著。各菌株抑菌活性与初筛结果无明显差异，表明各菌株抑菌活性相对稳定。 3 结论与讨论
本试验材料是从峨眉山海拔800 m左右的地方采集的天南星科健康植物异叶天南星，从根、茎、叶组织中共分离纯化得到26株内生细菌，这26株内生细菌对MRSA均有抑菌活性，但不同菌株抑菌活性存在差异。初筛中平均抑菌圈直径超过12 mm的菌株有12株，这12株菌株在复筛中仍然表现出较强的抑菌活性，其中YG009、YJ009对MRSA的抑菌活性最强，有进一步研究开发抗MRSA新药的潜力。
从健康植株异叶天南星根、茎、叶中分别分离得到内生细菌，植株不同组织部位的内生细菌对病原菌MRSA的抑菌效果不同，从初筛、复筛结果来看，异叶天南星根、茎分离得到的内生细菌对MRSA的抑菌活性更强，这与异叶天南星主要以根入药相吻合，同时表明茎可能也具有较好的药用价值。
不同内生细菌在初筛、复筛试验中对MRSA的抑菌活性相对稳定，表明这些内生细菌产生抗MRSA活性物质能力是可以稳定遗传的。
参考文献：
[1]宋良科. 峨眉山天南星科药用植物资源研究[J]. 中国野生植物资源，2006，25（1）：35-36，52.
[2]赵 清，郭 辉，崔桂华. 几种天南星科药用植物的相似性研究[J]. 河北医药，2009，31（21）：2975-2977.
[3]孙红祥，叶益萍. 天南星类药材的综合质量评价[J]. 生物数学学报，2003，18（2）：243-248.
[4]江 曙，钱大玮，段金廒，等. 植物内生菌与道地药材的相关性研究[J]. 中草药，2008，39（8）：1268-1272.
[5]Hiramatsu K，Katayama Y，Yuzawa H，et al. Molecular genetics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Medical Microbiology，2002，292（2）：67-74.
[6]黄 辉，陈 颖，安如俊，等. MRSA中mecA及femB基因的检测与耐药相关性[J]. 微生物学杂志，2009，29（3）：54-56.
[7]王天昊，馬朋林. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的管理：关注宿主[J]. 临床药物治疗杂志，2012，9（5）：5-7.
关键词：异叶天南星；内生细菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；峨眉山；筛选
中图分类号： S567.23 9.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0388-02
异叶天南星（Arisema heterophyllum Blume）为天南星科天南星属多年生草本植物，全国各地均有分布，主要以块茎入药[1]。相关研究结果表明，天南星科药用植物在毒性、刺激性、药用成分、药理活性等很多方面的相似性可以达到80%以上[2]，因此异叶天南星具有与天南星科药用植物相似的功效，且对惊厥等疾病有较好治疗作用[3]。植物的内生菌（endophyte）是指在一定或全部阶段生活在健康植物组织内部的微生物，普遍存在于高等植物中。内生菌由于长期生活在植物组织内部而与植物和谐生长，能够产生与宿主植物所产生的相同或相似的活性化合物[4]。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是临床上常见的1种毒性比较强的细菌[5]，是金黄色葡萄球菌的1种，但能够耐甲氧西林，可引起多种化脓性疾病。MRSA除了对甲氧西林有耐药性外，还对临床上应用的多种抗生素具有耐药性，所导致的感染呈暴发性或散发性流行，治疗极其困难，致死率极高，成为全世界范围内抗感染的难题[6]。从药用植物中筛选出抗MRSA的内生细菌，对于预防和控制由MRSA引起的感染具有重要意义[7]。本研究从采自峨眉山的异叶天南星的根、茎、叶组织中分离内生细菌，采用牛津杯法测定内生细菌对MRSA的抑菌活性，从中筛选抗MRSA活性强的菌株，为抗MRSA新药筛选及峨眉山异叶天南星的保护及开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2013年8月5日从峨眉山万年寺（海拔约800 m）附近采集健康的异叶天南星植株，采集后立即保存于袋内，并迅速带回实验室进行内生细菌的分离。MRSA由峨眉山特色生物资源重点实验室提供。
1.2 内生细菌的分离
分别取健康异叶天南星的根、茎、叶5～10 g，用自来水冲洗表面的泥土等污物后用无菌水冲洗3～5次，再分别用有效氯含量为5%的次氯酸钠消毒2 min、75%乙醇消毒 1 min、01%HgCl消毒5 min，再用无菌水冲洗3～5次后放入无菌搅拌机中打浆，粉碎的组织液置于无菌的三角瓶中备用。分别取最后1次冲洗液和粉碎的组织液各1 mL，稀释10 000倍，涂布于NA平板培养基（蛋白胨0.3%、牛肉膏05%、NaC1 0.5%、葡萄糖0.5%、琼脂1.8%～2.0%、pH值7.0）上，于 28 ℃ 下培养，逐日观察。将挑取的单菌落划线纯化后接种至斜面培养基，28 ℃培养5～7 d，之后于4 ℃保藏菌种。
1.3 异叶天南星拮抗性内生细菌初筛
在NA平板上涂布接种100 μL MRSA培养液，将异叶天南星内生细菌的菌饼（直径7 ㎜）有菌面平整贴在平板表面，28 ℃培养2～3 d后用十字交叉法测量抑菌圈直径，即通过2次十字方位来测量同一抑菌圈的直径，然后再将测得的2次数据求平均值，即为该内生细菌抑菌圈的直径。以无菌的培养基饼（直径7 mm）代替内生细菌接种作为对照，每个处理重复3次。
1.4 异叶天南星拮抗性内生细菌复筛
为了获得抑菌能力较稳定、较强的菌株，将初筛获得的活性菌株纯培养后制成菌悬液。在NA培养基上涂布接种 100 μL MRSA培养液，涂布均匀，每个平板中等距离均匀插入3个牛津杯（直径7 mm），每个牛津杯接种同种活性菌株菌悬液100 μL。28 ℃培养2～3 d后用十字交叉法测量抑菌圈直径。在牛津杯中注入100 μL无菌水代替活性菌株菌悬液接种作为对照，每个处理重复3次。
2 结果与分析
2.1 异叶天南星内生细菌的分离纯化
采用组织液涂布分离方法从异叶天南星健康植株的根、茎、叶中共分离纯化得到26株内生细菌。其中从根中分离出9种菌株，编号依次为YG001-YG009；从茎中分离出11种菌株，编号依次为YJ001-YJ011；从叶中分离出6种菌株，编号依次为YY001-YY006。
2.2 抗MRSA内生细菌初筛结果
将分离纯化得到的26株异叶天南星的内生细菌制成菌饼，然后采用平板对峙法测定内生细菌对MRSA的抑菌活性。结果表明，26株内生细菌对MRSA均有抑菌活性，但各菌株间抑菌活性存在较大差异（表1），其中平均抑菌圈直径超过12 mm的菌株有12种，分别为YG009、YJ009、YJ004、YJ002、YJ006、YJ003、YG001、YG008、YJ011、YJ007、YY003、YY001，選取这12株内生细菌进行复筛。
2.3 抗MRSA内生细菌复筛结果
对初筛中抑菌直径超过12 mm的12株菌株采用牛津杯法复筛，结果表明，12株菌株对MRSA均具有较高的抑菌活性（表2）。其中YG009、YJ009对MRSA的抑菌活性最强，与其他菌株差异极显著。各菌株抑菌活性与初筛结果无明显差异，表明各菌株抑菌活性相对稳定。 3 结论与讨论
本试验材料是从峨眉山海拔800 m左右的地方采集的天南星科健康植物异叶天南星，从根、茎、叶组织中共分离纯化得到26株内生细菌，这26株内生细菌对MRSA均有抑菌活性，但不同菌株抑菌活性存在差异。初筛中平均抑菌圈直径超过12 mm的菌株有12株，这12株菌株在复筛中仍然表现出较强的抑菌活性，其中YG009、YJ009对MRSA的抑菌活性最强，有进一步研究开发抗MRSA新药的潜力。
从健康植株异叶天南星根、茎、叶中分别分离得到内生细菌，植株不同组织部位的内生细菌对病原菌MRSA的抑菌效果不同，从初筛、复筛结果来看，异叶天南星根、茎分离得到的内生细菌对MRSA的抑菌活性更强，这与异叶天南星主要以根入药相吻合，同时表明茎可能也具有较好的药用价值。
不同内生细菌在初筛、复筛试验中对MRSA的抑菌活性相对稳定，表明这些内生细菌产生抗MRSA活性物质能力是可以稳定遗传的。
参考文献：
[1]宋良科. 峨眉山天南星科药用植物资源研究[J]. 中国野生植物资源，2006，25（1）：35-36，52.
[2]赵 清，郭 辉，崔桂华. 几种天南星科药用植物的相似性研究[J]. 河北医药，2009，31（21）：2975-2977.
[3]孙红祥，叶益萍. 天南星类药材的综合质量评价[J]. 生物数学学报，2003，18（2）：243-248.
[4]江 曙，钱大玮，段金廒，等. 植物内生菌与道地药材的相关性研究[J]. 中草药，2008，39（8）：1268-1272.
[5]Hiramatsu K，Katayama Y，Yuzawa H，et al. Molecular genetics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Medical Microbiology，2002，292（2）：67-74.
[6]黄 辉，陈 颖，安如俊，等. MRSA中mecA及femB基因的检测与耐药相关性[J]. 微生物学杂志，2009，29（3）：54-56.
[7]王天昊，馬朋林. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的管理：关注宿主[J]. 临床药物治疗杂志，2012，9（5）：5-7.