【摘 要】
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目的:通过原核表达并纯化靶向内皮细胞的小鼠Notch重组配体mD1R蛋白,观察其对四氯化碳损伤后造血的影响.方法:PCR克隆并构建pET22b(+)-mD1R表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导,
【机 构】
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解放军第四二一医院肿瘤血液科,广东广州,510318西安高新医院血液科,陕西西安,710075;第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安,710032;
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目的:通过原核表达并纯化靶向内皮细胞的小鼠Notch重组配体mD1R蛋白,观察其对四氯化碳损伤后造血的影响.方法:PCR克隆并构建pET22b(+)-mD1R表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导,镍珠亲合层析纯化,SDS-PAGE确认目的蛋白表达.应用流式细胞术、细胞粘附实验、免疫荧光染色及实时定量RT-PCR检测蛋白的内皮靶向性和Notch激活程度.建立四氯化碳损伤小鼠模型,应用流式细胞术观察mD1R蛋白对造血干细胞(HSC)、髓系和淋系细胞的影响,应用磁珠分选Lin-Scal-1+ c-Kit+细胞并分析细胞周期的变化,RT-PCR检测IL-10的表达.结果:成功克隆并构建原核表达载体,获得高纯度且有生物学活性的mD1R重组蛋白.mD1R能激活四氯化碳损伤小鼠造血干/祖细胞的Notch信号途径,内源性扩增HSC和长期HSC达2.96倍和6.18倍,促进了髓系祖细胞及髓源性抑制细胞的自体扩增,尤其有利于粒/单核细胞进入血液循环,其具体机制可能与Notch信号促进应激损伤后造血干细胞增殖和上调IL-10表达有关.结论:成功构建了连接造血干细胞和造血微环境的新型Notch配体活性蛋白,证实Notch信号途径可能通过促抗炎因子表达,实现应激损伤后自体造血动员.
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