【摘 要】
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目的 了解钩端螺旋体毒素-抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长vapB、vapC
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目的 了解钩端螺旋体毒素-抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长vapB、vapC、vapBC基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rVapB和rVapC 表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rVapB和rVapC.检测rVapB和rVapC有无水解问号钩体赖株及THP-1细胞DNA或RNA活性.分别采用实时荧光定量PCR和Western blot试验,检测问号钩体赖株感染THP-1细胞前后vapB和vapC基因转录及表达水平的变化.构建vapB和vapC基因真核表达载体并转染细胞,采用CCK-8试剂检测VapB和VapC蛋白对细胞活性的影响.结果 所克隆的vapB和vapC基因核苷酸及氨基酸序列与文献报道完全相同.所构建的原核表达系统能分别表达rVapB 和rVapC.rVapC可水解RNA,但不水解DNA.问号钩体赖株感染THP-1细胞后,vapB和vapC基因 转录及表达水平均显著上调,部分毒性蛋白VapC外分泌.转染vapC基因的人肾小管上皮细胞HEK293大量死亡.结论 问号钩体赖株VapC蛋白为RNA酶,可在感染宿主细胞过程中外分泌并对细胞有明显毒性.
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