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目的
构建稳定表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的胶质瘤U87细胞株。
方法首先EGFRvⅢcDNA(2832bp)克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-puro的XbaⅠ和NotⅠ位点，引物中添加His6标签，测序鉴定；用磷酸钙沉淀法将含目的基因的质粒pCDH-CMV-EGFRvⅢ-EF1-puro与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.9和包膜蛋白质粒pVSV-G三质粒共转染293T细胞。过滤、浓缩包装好病毒后，利用稀释计数法测定病毒滴度。制备好的慢病毒感染U87细胞，经嘌呤霉素筛选、有限稀释克隆培养建立稳定表达细胞株。Western blot采用人EGFRvⅢ单抗、His6单抗检测筛选的细胞株，流式细胞术检测EGFRvⅢ在U87细胞表面的表达。
结果重组质粒pCDH-EGFRvⅢ经XbaⅠ和NotⅠ双酶切、1%琼脂糖凝胶电泳，产物与预期目的基因EGFRvⅢ cDNA(2 832 bp)大小一致；Western blot鉴定6株U87-vⅢ均表达EGFRvⅢ蛋白(145 kd)和His6(145 kd)；流式细胞术检测2株U87-vⅢ细胞株(U87-vⅢ-2、U87-vⅢ-4)表面均表达EGFRvⅢ蛋白(分别为93.1%、96.9%)。
结论稳定表达EGFRvⅢ的U87细胞株被成功建立，为胶质瘤的靶向治疗研究提供了基础。