【摘 要】
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旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用.本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDN A-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3\'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变
【机 构】
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河北农业大学动物科技学院,保定071001
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旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用.本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDN A-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3\'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共(或单独)转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体(miR-127 mimic/mimic NC)转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127(FOXO4)及凋亡基因(Casp3、Bax及BCL2)的表达水平.过表达转录因子FOX O4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性(P＜＜0.05)和oar-miR-127表达水平(P＜0.05);miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOX O4缺失/突变型重组质粒的细胞(P＜0.05).转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低(P＜0.05),Casp3和Bax基因表达水平极显著升高(P＜0.001);过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化(P＞0.05),但BCL2相对表达量显著降低(P＜0.05).本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOX O4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础.
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