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摘要 [目的]确定脱脂米糠球蛋白的最佳提取工艺。[方法]采用响应面分析法，优化由Osboren法提取出米糠球蛋白的提取条件，研究提取温度、料液比、提取时间和NaCl浓度对米糠球蛋白纯度的影响。[结果]试验表明，提取米糠球蛋白的最佳条件为料液比1∶12.06 g/ml、提取温度40.40 ℃、提取时间3.44 h、NaCl浓度2.04%。[结论] 研究可为今后米糠产品的深度开发和利用提供理论参考。
关键词 Osboren法；米糠球蛋白；响应面分析
中图分类号 S509.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-255-04
Abstract [Objective] To determine the optimal extraction technique for defatted rice bran globulin. [Method] Using response surface analysis method， the extraction conditions for rice bran globulin was optimized with Osboren method， the effects of extraction temperature， solidliquid ratio， time and NaCl concentration on purity of rice bran globulin were studied. [Result] Results indicated that the best process conditions of globulin of defatted rice bran were the 1∶12.06 g/ml ratio of liquor to material， 40.40 ℃ extract temperature，3.44 h extract time and 2.04% NaCl concentration. [Conclusion] The study can provide theoretical reference for deep development and utilization of bran products in the future.
Key words Osboren method； Rice bran globulin； Response surface analysis
米糠蛋白的特性是高营养、低过敏性，因此成为一种优质植物蛋白质资源。米糠蛋白组分中主要含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4种蛋白，各种分离蛋白的性质和功能特性各不相同，因此人们可以根据各种分级蛋白的不同性质加以利用，这样不但可以增加可利用的植物蛋白种类，又可增加米糠的附加值，具有重要的现实意义。在米糠分级蛋白中，清蛋白和球蛋白是由单链组成的低分子量蛋白质，它为代谢活性蛋白质，含有很多生理活性蛋白质，在稻谷发芽早期可迅速启动进行生理作用[1]。近些年，国内外对其他物质的分级蛋白有大量的研究，研究表明，采用Osboren法对麦胚蛋白[2]进行分级提取，最终得到麦胚清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白；对燕麦麸[3]进行分级提取时，最终得出燕麦麸的4种分级蛋白并对蛋白进行分类；更进一步的研究是对每种蛋白的SDSPAGE电泳分析[4]，经电泳分析得出，每一种分离蛋白质亚基均小于53 kD，属于小分子量范围。
目前国内外对米糠蛋白组分研究的较少，并未见对其结构测定的报道，因此笔者参照Osboren方法对米糠中球蛋白进行提取，确定最佳提取工艺，以期对今后米糠产品的深度开发和利用提供现实的理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料和試剂。米糠，黑龙江省北大荒米业有限公司提供。试验用水为蒸馏水，其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 主要仪器。超临界萃取设备（HA12150），南通华安超临界CO2萃取有限公司；自动凯氏定氮仪，北京三品科创仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 脱脂米糠的制备。将新鲜米糠放入CO2超临界萃取装置中进行脱脂，分离得出的脱脂米糠放入冰箱中冷藏备用。
1.2.2 蛋白质含量的测定。蛋白质含量测定采用凯氏定氮法（GB/T 5511）[5]。
1.2.3 米糠球蛋白的制备。工艺路线：脱脂→水溶浸提→离心分离→取残渣→盐提→离心→上清液→等电点沉淀→清洗→冷冻干燥→米糠球蛋白粉。
1.2.3.1 蛋白纯度的测定。采用GB/5511-1985方法进行[6]蛋白纯度的测定。
1.2.3.2 米糠球蛋白提取工艺的单因素试验。试验以蛋白纯度为研究指标，研究料液比、提取时间、提取温度、NaCl浓度对蛋白纯度的影响，对米糠球蛋白提取工艺进行单因素试验。
提取温度的确定： 称取20份残渣，用2%料液比为1∶10 g/ml的NaCl溶液溶解，设定提取温度为35、40、45、50、55 ℃，设定提取时间为2 h，进行试验，离心提取上清液，测定上清液的米糠球蛋白纯度。液料比的确定：用2%的NaCl溶液溶解沉淀，在料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/ml，45 ℃的条件下提取2 h，离心后对上清液进行米糠球蛋白纯度的测定。提取时间的确定：用2%料液比为1∶10 g/ml的NaCl溶液溶解沉淀，在45 ℃条件下提取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，离心测定上清液的米糠球蛋白纯度。NaCl溶液浓度的确定：料液比为1∶10 g/ml，NaCl溶液的浓度在1%、2%、3%、4%、5%，在45 ℃条件下提取2 h，离心后对上清液进行米糠球蛋白纯度测定。 1.2.3.3 优化米糠球蛋白蛋白提取工艺。
以提取时间（A）、温度（B）、料液比（C）、NaCl浓度（D）4个因素的单因素试验结果，采用二次旋转回归正交组合试验设计，以蛋白提取率为响应值，按照表1的试验设计进行试验，采用4因素5水平的响应面分析，利用DesignExpert8.0.5统计软件进行数据处理和回归分析，建立蛋白提取率与各因素关系的数学模型，最后通过对模型分析得出最佳提取工艺条件。
2 结果与分析
2.1 提取温度对米糠球蛋白纯度的影响
由图1可知，米糠球蛋白纯度在50 ℃时达到最大值，在50 ℃之前，米糠球蛋白纯度随提取温度的升高逐渐增大，而后随温度的继续升高缓慢下降。这可能是由于温度过高，使得米糠球蛋白得性质发生了变化，比如糊化等因素，因此提取的温度最好在50 ℃以内。
2.2 料液比对米糠球蛋白纯度的影响
由图2可以看出，在料液比为1∶10 g/ml时米糠球蛋白的纯度最大，继续增加料液比，蛋白纯度则呈现降低趋势。这可能是与蛋白分解以及提取液的蛋白浓度降低有关。与清蛋白相比，球蛋白的最佳料液比相对减少了很多，分析原因可能是由于经过清蛋白提取后，原料已吸收一部分水分，再提取球蛋白时，料液比明显降低[7]。
2.3 提取时间对米糠球蛋白纯度的影响
由图3可知，球蛋白纯度在2.0 h处达到最大值，随着温度的增加，纯度逐渐下降。分析原因可能是随提取时间延长使得米糠球蛋白发生了部分水解，使蛋白质得率降低从而影响蛋白纯度。
2.4 NaCl浓度对米糠球蛋白纯度的影响
由图4可以看出，当NaCl浓度达到3%时，米糠球蛋白的纯度达到最大值，而后呈现下降趋势。分析原因可能是由于高浓度的盐使得溶液的黏度增大，影响蛋白的溶解，并残留一些杂質，从而影响米糠球蛋白的纯度。
2.5 米糠球蛋白纯度回归方程的建立与检查
采用4因素5水平的响应面法进行米糠清蛋白质提取工艺的优化，结果见表2。
由复相关系数R=0.979 1，以及方差分析结果P<0.000 1，所以建立的四元二次回归方程非常显著，与试验数据拟合很好。
由方差分析可知，回归方程显著性检验F=27.63>F0.01（14，16）=3.45极显著，说明所建立的回归模型预测值和实际值的吻合较好，模型成立。一次项、交互项和二次项F值都大于0.01，说明各个因素之间的交互作用对米糠球蛋白的纯度有显著性的影响。一次项除D不显著外，其他都极显著，二次项都是极显著，交互差项只有AB、BC极显著，其他都是不显著。由此可知，影响米糠球蛋白纯度的因素的主要次序为料液比、提取温度、提取时间、NaCl浓度。
提取温度和料液比的相互作用对米糠球蛋白的纯度影响响应面分析如图5。
由图5可知，随着提取温度和料液比的不断升高，米糠球蛋白纯度不断增加，直到达到最高点；当提取的温度和料液比继续增加时，蛋白质的纯度反而开始下降。由此可知，提取温度和料液比过高或过低，都会对米糠球蛋白的纯度造成影响，不能使蛋白纯度达到最大值。
料液比和提取时间的相互作用对米糠球蛋白的纯度影响响应面分析如图6。
由图6可知，当液料比不断增加时，米糠球蛋白的纯度开始先增加，而后逐渐减小；当提取时间不断增加时，米糠球蛋白的纯度先升高后降低。这说明，只有当液料比和提取时间共同升高，并且达到一定的程度时，米糠球蛋白的纯度才会达到最高值。因此，这2种因素存在着交互作用的关系。
2.6 提取工艺参数的优化组合及结果验证
通过DesignExpert 8.0.5统计软件响应面分析模拟得出的米糠球蛋白的纯度最大值为96.528 4%，其优化组合为A=0.040、B=0.516、C=0.941、D=-0.480，即最佳的提取工艺参数为：料液比为1∶12.06 g/ml、提取温度为40.40 ℃、提取时间为3.44 h、NaCl浓度2.04%。由最优组合的预测值得出的验证结果显示，蛋白纯度为94.79%。预测值与实际值基本一致，说明预测条件与实际的测定情况比较符合。
3 结论
该试验利用Osbron法提取出米糠球蛋白，通过单因素试验、数据优化和响应面分析得到以下结论：以米糠球蛋白的纯度为响应值，建立回归模型方程为Y=91.18+2.58A+10.74B+4.39C-1.90D-1.35AB-1.66AC-0.391AD+2.39BC-0.50BD-3.14CD-6.33A2-12.76B2-3.76C2-5.33D2（R2=0.979 1）。
米糠球蛋白纯度的主要影响因素顺序是料液比、提取温度、提取时间、NaCl浓度。
由二次旋转回归正交组合的设计，确定出提取米糠球蛋白的最佳工艺条件为料液比为1∶12.06 g/ml、提取温度为40.40 ℃、提取时间为3.44 h、NaCl浓度2.04%，在这种条件下，可以得到理论的蛋白纯度为96.64%，试验中所测得的蛋白纯度为94.79%。
参考文献
[1] 康艳玲，王章存.米糠蛋白研究现状[J].粮食与油脂，2006（3）：22-24.
[2] 张春红，周小婷.小麦胚蛋白分级提取及功能性研究[J].粮油加工，2009（5）：94-96.
[3] 管骁，姚惠源.燕麦麸蛋白的组成及功能性质研究[J].食品科学，2006，27（7）：72-76.
[4] 冯明珠，何聪芬，赵华，等.燕麦麸蛋白质的Osboren分类及SDSPAGE电泳分析[J].食品工业科技，2007， 28（1）：77-79.
[5] 谢笔钧.食品化学[M].北京：科学出版社， 2004：217-219.
[6] 刘魁英.食品研究与数据分析[M].北京：中国轻工业出版社，2005：123-126.
[7] 王艳玲，张敏.脱脂米糠中清蛋白和球蛋白的提取工艺及氨基酸组成分析[J/OL].（2012-11-06）http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20121106.1501.007.html.
关键词 Osboren法；米糠球蛋白；响应面分析
中图分类号 S509.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-255-04
Abstract [Objective] To determine the optimal extraction technique for defatted rice bran globulin. [Method] Using response surface analysis method， the extraction conditions for rice bran globulin was optimized with Osboren method， the effects of extraction temperature， solidliquid ratio， time and NaCl concentration on purity of rice bran globulin were studied. [Result] Results indicated that the best process conditions of globulin of defatted rice bran were the 1∶12.06 g/ml ratio of liquor to material， 40.40 ℃ extract temperature，3.44 h extract time and 2.04% NaCl concentration. [Conclusion] The study can provide theoretical reference for deep development and utilization of bran products in the future.
Key words Osboren method； Rice bran globulin； Response surface analysis
米糠蛋白的特性是高营养、低过敏性，因此成为一种优质植物蛋白质资源。米糠蛋白组分中主要含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4种蛋白，各种分离蛋白的性质和功能特性各不相同，因此人们可以根据各种分级蛋白的不同性质加以利用，这样不但可以增加可利用的植物蛋白种类，又可增加米糠的附加值，具有重要的现实意义。在米糠分级蛋白中，清蛋白和球蛋白是由单链组成的低分子量蛋白质，它为代谢活性蛋白质，含有很多生理活性蛋白质，在稻谷发芽早期可迅速启动进行生理作用[1]。近些年，国内外对其他物质的分级蛋白有大量的研究，研究表明，采用Osboren法对麦胚蛋白[2]进行分级提取，最终得到麦胚清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白；对燕麦麸[3]进行分级提取时，最终得出燕麦麸的4种分级蛋白并对蛋白进行分类；更进一步的研究是对每种蛋白的SDSPAGE电泳分析[4]，经电泳分析得出，每一种分离蛋白质亚基均小于53 kD，属于小分子量范围。
目前国内外对米糠蛋白组分研究的较少，并未见对其结构测定的报道，因此笔者参照Osboren方法对米糠中球蛋白进行提取，确定最佳提取工艺，以期对今后米糠产品的深度开发和利用提供现实的理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料和試剂。米糠，黑龙江省北大荒米业有限公司提供。试验用水为蒸馏水，其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 主要仪器。超临界萃取设备（HA12150），南通华安超临界CO2萃取有限公司；自动凯氏定氮仪，北京三品科创仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 脱脂米糠的制备。将新鲜米糠放入CO2超临界萃取装置中进行脱脂，分离得出的脱脂米糠放入冰箱中冷藏备用。
1.2.2 蛋白质含量的测定。蛋白质含量测定采用凯氏定氮法（GB/T 5511）[5]。
1.2.3 米糠球蛋白的制备。工艺路线：脱脂→水溶浸提→离心分离→取残渣→盐提→离心→上清液→等电点沉淀→清洗→冷冻干燥→米糠球蛋白粉。
1.2.3.1 蛋白纯度的测定。采用GB/5511-1985方法进行[6]蛋白纯度的测定。
1.2.3.2 米糠球蛋白提取工艺的单因素试验。试验以蛋白纯度为研究指标，研究料液比、提取时间、提取温度、NaCl浓度对蛋白纯度的影响，对米糠球蛋白提取工艺进行单因素试验。
提取温度的确定： 称取20份残渣，用2%料液比为1∶10 g/ml的NaCl溶液溶解，设定提取温度为35、40、45、50、55 ℃，设定提取时间为2 h，进行试验，离心提取上清液，测定上清液的米糠球蛋白纯度。液料比的确定：用2%的NaCl溶液溶解沉淀，在料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/ml，45 ℃的条件下提取2 h，离心后对上清液进行米糠球蛋白纯度的测定。提取时间的确定：用2%料液比为1∶10 g/ml的NaCl溶液溶解沉淀，在45 ℃条件下提取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，离心测定上清液的米糠球蛋白纯度。NaCl溶液浓度的确定：料液比为1∶10 g/ml，NaCl溶液的浓度在1%、2%、3%、4%、5%，在45 ℃条件下提取2 h，离心后对上清液进行米糠球蛋白纯度测定。 1.2.3.3 优化米糠球蛋白蛋白提取工艺。
以提取时间（A）、温度（B）、料液比（C）、NaCl浓度（D）4个因素的单因素试验结果，采用二次旋转回归正交组合试验设计，以蛋白提取率为响应值，按照表1的试验设计进行试验，采用4因素5水平的响应面分析，利用DesignExpert8.0.5统计软件进行数据处理和回归分析，建立蛋白提取率与各因素关系的数学模型，最后通过对模型分析得出最佳提取工艺条件。
2 结果与分析
2.1 提取温度对米糠球蛋白纯度的影响
由图1可知，米糠球蛋白纯度在50 ℃时达到最大值，在50 ℃之前，米糠球蛋白纯度随提取温度的升高逐渐增大，而后随温度的继续升高缓慢下降。这可能是由于温度过高，使得米糠球蛋白得性质发生了变化，比如糊化等因素，因此提取的温度最好在50 ℃以内。
2.2 料液比对米糠球蛋白纯度的影响
由图2可以看出，在料液比为1∶10 g/ml时米糠球蛋白的纯度最大，继续增加料液比，蛋白纯度则呈现降低趋势。这可能是与蛋白分解以及提取液的蛋白浓度降低有关。与清蛋白相比，球蛋白的最佳料液比相对减少了很多，分析原因可能是由于经过清蛋白提取后，原料已吸收一部分水分，再提取球蛋白时，料液比明显降低[7]。
2.3 提取时间对米糠球蛋白纯度的影响
由图3可知，球蛋白纯度在2.0 h处达到最大值，随着温度的增加，纯度逐渐下降。分析原因可能是随提取时间延长使得米糠球蛋白发生了部分水解，使蛋白质得率降低从而影响蛋白纯度。
2.4 NaCl浓度对米糠球蛋白纯度的影响
由图4可以看出，当NaCl浓度达到3%时，米糠球蛋白的纯度达到最大值，而后呈现下降趋势。分析原因可能是由于高浓度的盐使得溶液的黏度增大，影响蛋白的溶解，并残留一些杂質，从而影响米糠球蛋白的纯度。
2.5 米糠球蛋白纯度回归方程的建立与检查
采用4因素5水平的响应面法进行米糠清蛋白质提取工艺的优化，结果见表2。
由复相关系数R=0.979 1，以及方差分析结果P<0.000 1，所以建立的四元二次回归方程非常显著，与试验数据拟合很好。
由方差分析可知，回归方程显著性检验F=27.63>F0.01（14，16）=3.45极显著，说明所建立的回归模型预测值和实际值的吻合较好，模型成立。一次项、交互项和二次项F值都大于0.01，说明各个因素之间的交互作用对米糠球蛋白的纯度有显著性的影响。一次项除D不显著外，其他都极显著，二次项都是极显著，交互差项只有AB、BC极显著，其他都是不显著。由此可知，影响米糠球蛋白纯度的因素的主要次序为料液比、提取温度、提取时间、NaCl浓度。
提取温度和料液比的相互作用对米糠球蛋白的纯度影响响应面分析如图5。
由图5可知，随着提取温度和料液比的不断升高，米糠球蛋白纯度不断增加，直到达到最高点；当提取的温度和料液比继续增加时，蛋白质的纯度反而开始下降。由此可知，提取温度和料液比过高或过低，都会对米糠球蛋白的纯度造成影响，不能使蛋白纯度达到最大值。
料液比和提取时间的相互作用对米糠球蛋白的纯度影响响应面分析如图6。
由图6可知，当液料比不断增加时，米糠球蛋白的纯度开始先增加，而后逐渐减小；当提取时间不断增加时，米糠球蛋白的纯度先升高后降低。这说明，只有当液料比和提取时间共同升高，并且达到一定的程度时，米糠球蛋白的纯度才会达到最高值。因此，这2种因素存在着交互作用的关系。
2.6 提取工艺参数的优化组合及结果验证
通过DesignExpert 8.0.5统计软件响应面分析模拟得出的米糠球蛋白的纯度最大值为96.528 4%，其优化组合为A=0.040、B=0.516、C=0.941、D=-0.480，即最佳的提取工艺参数为：料液比为1∶12.06 g/ml、提取温度为40.40 ℃、提取时间为3.44 h、NaCl浓度2.04%。由最优组合的预测值得出的验证结果显示，蛋白纯度为94.79%。预测值与实际值基本一致，说明预测条件与实际的测定情况比较符合。
3 结论
该试验利用Osbron法提取出米糠球蛋白，通过单因素试验、数据优化和响应面分析得到以下结论：以米糠球蛋白的纯度为响应值，建立回归模型方程为Y=91.18+2.58A+10.74B+4.39C-1.90D-1.35AB-1.66AC-0.391AD+2.39BC-0.50BD-3.14CD-6.33A2-12.76B2-3.76C2-5.33D2（R2=0.979 1）。
米糠球蛋白纯度的主要影响因素顺序是料液比、提取温度、提取时间、NaCl浓度。
由二次旋转回归正交组合的设计，确定出提取米糠球蛋白的最佳工艺条件为料液比为1∶12.06 g/ml、提取温度为40.40 ℃、提取时间为3.44 h、NaCl浓度2.04%，在这种条件下，可以得到理论的蛋白纯度为96.64%，试验中所测得的蛋白纯度为94.79%。
参考文献
[1] 康艳玲，王章存.米糠蛋白研究现状[J].粮食与油脂，2006（3）：22-24.
[2] 张春红，周小婷.小麦胚蛋白分级提取及功能性研究[J].粮油加工，2009（5）：94-96.
[3] 管骁，姚惠源.燕麦麸蛋白的组成及功能性质研究[J].食品科学，2006，27（7）：72-76.
[4] 冯明珠，何聪芬，赵华，等.燕麦麸蛋白质的Osboren分类及SDSPAGE电泳分析[J].食品工业科技，2007， 28（1）：77-79.
[5] 谢笔钧.食品化学[M].北京：科学出版社， 2004：217-219.
[6] 刘魁英.食品研究与数据分析[M].北京：中国轻工业出版社，2005：123-126.
[7] 王艳玲，张敏.脱脂米糠中清蛋白和球蛋白的提取工艺及氨基酸组成分析[J/OL].（2012-11-06）http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20121106.1501.007.html.