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目的
以含有凝血因子Ⅸ（FⅨ）cDNA的pcDNA/FⅨ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨ并检测其在HEK-293细胞中的表达。
方法以pcDNA/FⅨ质粒为模板，扩增出目的基因FⅨ的开放阅读框（ORF）区，使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅨORF扩增产物进行连接，连接产物进行转化后筛选阳性克隆，对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定。野生型pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染HEK-293细胞后，分别采用实时定量PCR、细胞免疫荧光法、一期法检测野生型FⅨ基因mRNA表达水平、蛋白的表达量及细胞裂解液、细胞培养液的FⅨ活性。
结果成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅨ并转染HEK-293细胞，实时定量PCR证实HEK-293细胞表达FⅨ mRNA，激光共聚焦显微镜下观察到FⅨ蛋白在细胞质中合成，野生型质粒pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染HEK-293细胞裂解液和细胞培养液的FⅨ活性分别为（92.03±0.29）%、（86.89±8.78）%，无转染的HEK-293细胞裂解液和培养液中FⅨ活性均为0。
结论成功构建FⅨ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体。