论文部分内容阅读
目的:研究14-3-3ε和Cdc25B对小鼠卵母细胞生发泡(GV)期阻滞作用的影响,为阐明蛋白激酶A/Cdc25B/14-3-3ε通路在小鼠卵母细胞GV期阻滞中发育调控机制奠定基础。方法:在体外将表达载体pcDNA3.1-ZEO-HA14-3-3ε、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321A和pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321D转录成mRNA。超排卵方法获得小鼠GV期卵母细胞,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组,收集各组母卵细胞后采用Western blotting法检测外源性14-3-3ε和Cdc25B蛋白表达及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态;相差显微镜观察卵母细胞的形态学变化并计数生发泡破裂(GVBD)率。结果:未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型)mRNA共注射组在显微注射后20h均未发生GVBD(P>0.05);14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组在显微注射后1、2和3h卵母细胞的GVBD率分别为(5.00±0.68)%、(62.00±3.56)%和(100.00±0.00)%,显微注射后20h到达第2次减数分裂中期(MII)的比例为(79.00±2.80)%,与未注射组和TE缓冲液注射组比较,GVBD率和到达MII的比例均显著升高(P<0.01)。结论:14-3-3ε通过Cdc25B的321位丝氨酸磷酸化和脱磷酸化调控卵母细胞由GV期向GVBD的过渡。