【摘 要】
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[目的]基于Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路探讨去毒附子汤(detoxicated Fuzi decoction,FZT)对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的作用及相关机制.[方法]将30
【机 构】
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浙江中医药大学第一临床医学院,浙江省肿瘤医院,海军军医大学附属长征医院
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(81774331、82074464),浙江省基础公益研究计划项目(LY20H270014)。
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[目的]基于Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路探讨去毒附子汤(detoxicated Fuzi decoction,FZT)对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)的作用及相关机制.[方法]将30只雌性无特殊病原体(specific pathogen free,SPF)级SD大鼠随机分为正常组,模型组,FZT低、中、高剂量组,每组6只.模型组,FZT低、中、高剂量组均采用碘乙酸关节腔注射造模法构建大鼠KOA模型.建模成功后,FZT低、中、高剂量组分别以2.4、4.8、9.6 g·kg-1的FZT灌胃,模型组和正常组以同剂量的0.9％氯化钠溶液灌胃,连续4周.首次给药前和末次给药后,对各组大鼠进行疼痛行为学检测.末次给药后1周,取各组大鼠膝关节软骨组织,进行番红O染色和Mankin评分.分离大鼠原代软骨细胞进行培养,以不同浓度的FZT含药血清进行干预,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法测定FZT含药血清对软骨细胞增殖活力的影响,选取最佳浓度.将软骨细胞随机分为NC组、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)组、TNF-α+FZT组,TNF-α+FZT组以10％的FZT含药血清干预,其余组使用空白培养基处理,以实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)检测2型胶原(collgen type 2,Col2)、10型胶原(collgen type 10,Col10)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶4(adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,Adamts4)、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶5(adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,Adamts5)、卷曲关联蛋白(frizzled-related protein,FRZB)、Wnt、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low density lipoprotein receptor related proteins 5/6,LRP5/6)、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)以及β-catenin的mRNA表达情况,Western blot检测Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β以及β-catenin的蛋白表达情况.[结果]疼痛行为学数据显示,模型组大鼠的热痛和压痛阈值显著低于正常组(P<0.01,P<0.01),FZT低、中、高剂量组大鼠的热痛和压痛阈值较模型组显著提高(均P<0.01).Mankin病理评分表明,模型组评分较正常组显著增高(P<0.01),FZT组评分较模型组显著降低(均P<0.01),且具有剂量依赖效应.MTT结果提示FZT含药血清能显著提高软骨细胞增殖活力.Real-time qPCR结果显示,与TNF-α组比较,FZT含药血清干预显著下调Col10、MMP13、Adamts4、Adamts5、Wnt、LRP5/6、GSK-3β及β-catenin的表达(均P<0.01),同时上调Col2的表达(P<0.01).Western blot结果显示,与TNF-α组比较,TNF-α+FZT组Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β以及β-catenin的蛋白表达减少(均P<0.01).[结论]FZT能显著改善KOA大鼠的疼痛行为学指标,修复软骨损伤,其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路以及软骨细胞分解代谢有关.
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