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摘要[目的]比较金太阳杏花粉量及花粉活力的测定方法。[方法]采摘金太阳杏各单株已达气球期、饱满、正常、未开裂的花蕾，收集花粉，通过染色法、离体萌发法测定花粉活力，研究不同浓度的蔗糖、硼酸对花粉萌发花粉管的影响，并测定每枚花药花粉量。[结果]通过2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定花粉活力为11.50%。对于离体萌发法，当培养温度为25 ℃、培养基pH为6.5、蔗糖浓度为10%、硼酸浓度为25 μg/mL时花粉萌发花粉管效果最好，此时花粉活力为27.00%。金太阳杏花粉量测定用单枚花药花粉量来衡量，测得单枚花药花粉量平均为1 303。[结论]试验结果为提高育种效率提供了理论依据。
关键词金太阳杏；花粉量；花粉活力
中图分类号S662.2文献标识码 A文章编号0517-6611（2016）30-0009-03
花粉不仅是植物遗传、育种、进化、生殖的重要研究对象，也是孢粉分析、蜂群培育、藥物制造、医疗及生理实验的重要材料。花粉活力是花粉具有生长、萌发或发育的能力[1]。在农业生产及农业常规杂交育种中，研究花粉的生活力和育性是基础性工作。农业生产和育种工作通常会遇到由于花期不一致带来的困难，为解决这一难题，保存花粉的活力成为重要手段，而在贮藏花粉之前必须先检测花粉的活力。不同种类植物花粉的自然寿命、适宜的贮藏方式及花粉活力适宜的测定方法不同。因此，掌握花粉活力的检测方法对提高育种效率有重要意义。
花粉活力的测定方法通常有形态学测定法、染色法、萌发测定法、田间授粉测定法和无机酸检测法。形态学测定法的基本原理是根据花粉自身的形状来判断花粉生活力[2]。该方法虽然简单，但测定有活力的花粉与实际值相差太大，且重复之间差异比较明显，一般不采用。田间授粉检测法的基本原理是根据果实和种子的形成情况来判断花粉生活力。虽然该方法较精确和可靠，可以得出花粉的活力，但是费时费力，还受到田间气候、环境条件及母本植株性状的影响。无机酸检测法是靠经过无机酸处理后，花粉会出现萌发孔有膨胀外突起的现象来判断花粉是否有活力，但花粉吸水后也会出现这种现象，因此，采用无机酸不能判断花粉是否真正具有活力[3-4]。染色法虽然简单、快速且能够在一定程度上直接反映花粉的活力，但受花粉特性的影响较大，不能直接表现出花粉的萌发率，所以不同植物应采用不同的染色法来检测花粉的活力。为此，笔者采用染色法中的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法、碘-碘化钾染色测定法、醋酸洋红染色测定法测定了金太阳杏花粉活力，以期为提高育种效率提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料以金太阳杏为供试植物。采集金太阳杏各单株已达气球期、饱满、正常、即将开裂的花蕾，用镊子收集其花药，在培养皿薄薄铺一层，25 ℃培养2 d，花粉即可爆出，在贮藏之前检测花粉活力[5]。
1.2方法
1.2.1染色法测定花粉活力。
（1）碘-碘化钾染色测定法。杏花在花粉成熟时积累淀粉较多，通常可用碘-碘化钾染成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，不积累淀粉，用碘-碘化钾染色，不呈蓝色，而呈黄褐色。取载玻片撒少量花粉，滴1～2滴碘-碘化钾溶液，35 ℃水浴中温浴20 min，然后在显微镜下观察，凡被染成蓝色的为发育好、活力强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒[6]。
（2）醋酸洋红染色测定法。其染色原理是靠花粉中的脱氢辅酶而染色，有活力的花粉被染成红色，部分失去活力的呈现粉红色，无活力或不育的花粉无色[7]。
取载玻片撒少量花粉，滴1～2滴醋酸洋红溶液，染色30 min后显微镜下观察，凡被染成红色的花粉为有活力的花粉，未被染色的花粉为无活力的花粉[8]。
（3）TTC染色测定法。TTC是一种氧化还原染料，水溶液无色。基本原理：当TTC渗入细胞后，遇到活细胞中的脱氢酶接受氢离子，由无色的氧化型变成红色的还原型不溶于水的化合物[9]，以此来判断花粉的生活力。取少量花粉置于载玻片上，加上1滴TTC溶液，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，然后置于35 ℃恒温箱中染色15～20 min。于10×10倍镜下观察，凡具有活力的花粉被染成红色，部分丧失活力的花粉呈现粉红色，无色是无活力或不育的花粉粒。制作3个装片，每片取5个视野，统计其花粉的活力百分率。
1.2.2花粉萌发测定法。
配制蔗糖浓度为5%、10%、15%，硼酸浓度为25、50、75 μg/mL的培养基，pH为6.5，用滴管吸取少量培养基，趁热滴在载玻片上，放置片刻使其凝固，将少量花粉均匀撒播在培养基上。将制好的片子放在垫有甘油湿润滤纸的培养皿内，在25 ℃温箱中培养1～2 d。每片取5个视野，待花粉萌发后置于显微镜下观察并统计发芽率[10]。
1.2.3花粉量的测定。
采集金太阳杏各单株已达气球期、饱满、正常、未开裂的花蕾，分别在4 ℃环境中保存0、4、8 h，各取完整的10朵单花花药放入1.5 mL离心管中，加入较低浓度番红溶液1.0 mL，高速离心机中离心3 min，使花粉粒均匀分布于溶液，用移液器吸取1 μL稀释液（每次吸取时要充分振荡）滴于载玻片上，显微镜下观察，统计每滴溶液中花粉粒数，每朵花观察3滴，重复3次[11]，计算每朵花药的花粉量。
每枚花药花粉量=每个载玻片总花粉粒数×1 000/单花花药数[2]
2结果与分析
2.1TTC染色测定金太阳杏花粉活力由表1数据计算得总平均数为11.50%，即TTC染色法测定金太阳杏花粉活力为11.50%。
2.2不同浓度蔗糖、硼酸对花粉萌发花粉管的影响
成熟花粉具有较强的生活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长。花粉的萌发和生长与培养条件、气候、花粉成熟度和植物种类等有关。硼酸对促进花粉萌发和花粉管伸长的作用机理是增加糖的吸收、运转和代谢，形成糖硼酸复合体，增加氧的吸收，并促进花粉管膜成分果胶物质的合成。一般来说，花粉中硼的含量是不足的，而在自然条件下，这种不足是由柱头和花柱内的硼所补偿的。因此，在离体培养时，需要添加适量浓度的硼酸，以促进花粉的萌发和生长。蔗糖对花粉萌发和花粉管的生长具有明显的促进作用，主要有2个方面：一方面为花粉萌发及花粉管的生长提供营养；另一方面维持外界环境一定的渗透压，使花粉壁破裂，内容物吐出，浓度高时又会造成花粉的质壁分离。因此，蔗糖的浓度一定要控制在合理范围内。 由表2可知，在温度25 ℃、pH 6.5、蔗糖浓度10%、硼酸浓度25 μg/mL条件下花粉的萌发率最高，即该条件下花粉活力最好，为27.00%。上述条件下花粉的萌发情况见图1。
2.3金太阳杏花花粉量的测定
取10株单花花药，记录每枚花药花粉量。每朵花取3滴药液，重复3次。由表3数据计算得金太阳杏每枚花药花粉量为1 303。
3讨论
花粉活力测定方法中，染色法较简单、快速，在一定程度上可以直接反映花粉活力，但是受花粉活性的影响，不能直接表现花粉的萌发率。例如，碘-碘化钾染色法测定花粉活力时有的发育不良、畸形的花粉中也有积累的淀粉，用碘-碘化钾溶液染色时，也出现蓝色从而使测量结果偏大，并且该方法不适合淀粉含量低的花粉，如菊属植物[10]。另外，该速测方法也在刚竹属[11]、水稻[12]、苜蓿[13]、辣椒[14]等的花粉速测上得到应用。TTC染色法虽然适用范围很广，一般用于葫芦科[15]、当归[16]、番木瓜[17]、连翘[18]、人心果[19]、一串红[20]、
月季[21]等花粉活力的检测，但是染色后的花粉颜色差别小，有活力的花粉边缘被染成红色，中间呈现黄褐色，而无活力的花粉整个呈现黄褐色，在显微镜下不易分辨。醋酸洋红染色法在苎麻[2]、西葫芦[15]、鸢尾属[22]等花粉活力测定上效果不理想，但在澳洲坚果[23]、胡萝卜[24]、马铃薯[25]等花粉活力快速检测上得到广泛应用。花粉离体萌发法中，二细胞型花粉一般在仅含蔗糖和硼酸的基本培养基上培养即可萌发，但三细胞型花粉则需加入其他元素，如十字花科、菊科、禾本科。在基本培养基中加入聚乙二烯（PEG）也可明显提高花粉的萌发率[26]。
参考文献
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[21] 王其刚，张颢，蹇洪英，等.月季‘云粉’、‘云玫’的花粉活力和柱头可授性研究[J].江西农业大学学报，2010，32（3）：458-461.
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[26] 杨秀莲，向其柏.桂花花粉活力测定与‘晚籽银’桂柱头可授性分析[J].林业科学开发，2007，21（3）：22-25.
关键词金太阳杏；花粉量；花粉活力
中图分类号S662.2文献标识码 A文章编号0517-6611（2016）30-0009-03
花粉不仅是植物遗传、育种、进化、生殖的重要研究对象，也是孢粉分析、蜂群培育、藥物制造、医疗及生理实验的重要材料。花粉活力是花粉具有生长、萌发或发育的能力[1]。在农业生产及农业常规杂交育种中，研究花粉的生活力和育性是基础性工作。农业生产和育种工作通常会遇到由于花期不一致带来的困难，为解决这一难题，保存花粉的活力成为重要手段，而在贮藏花粉之前必须先检测花粉的活力。不同种类植物花粉的自然寿命、适宜的贮藏方式及花粉活力适宜的测定方法不同。因此，掌握花粉活力的检测方法对提高育种效率有重要意义。
花粉活力的测定方法通常有形态学测定法、染色法、萌发测定法、田间授粉测定法和无机酸检测法。形态学测定法的基本原理是根据花粉自身的形状来判断花粉生活力[2]。该方法虽然简单，但测定有活力的花粉与实际值相差太大，且重复之间差异比较明显，一般不采用。田间授粉检测法的基本原理是根据果实和种子的形成情况来判断花粉生活力。虽然该方法较精确和可靠，可以得出花粉的活力，但是费时费力，还受到田间气候、环境条件及母本植株性状的影响。无机酸检测法是靠经过无机酸处理后，花粉会出现萌发孔有膨胀外突起的现象来判断花粉是否有活力，但花粉吸水后也会出现这种现象，因此，采用无机酸不能判断花粉是否真正具有活力[3-4]。染色法虽然简单、快速且能够在一定程度上直接反映花粉的活力，但受花粉特性的影响较大，不能直接表现出花粉的萌发率，所以不同植物应采用不同的染色法来检测花粉的活力。为此，笔者采用染色法中的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法、碘-碘化钾染色测定法、醋酸洋红染色测定法测定了金太阳杏花粉活力，以期为提高育种效率提供理论依据。
1材料与方法
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1.2方法
1.2.1染色法测定花粉活力。
（1）碘-碘化钾染色测定法。杏花在花粉成熟时积累淀粉较多，通常可用碘-碘化钾染成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，不积累淀粉，用碘-碘化钾染色，不呈蓝色，而呈黄褐色。取载玻片撒少量花粉，滴1～2滴碘-碘化钾溶液，35 ℃水浴中温浴20 min，然后在显微镜下观察，凡被染成蓝色的为发育好、活力强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒[6]。
（2）醋酸洋红染色测定法。其染色原理是靠花粉中的脱氢辅酶而染色，有活力的花粉被染成红色，部分失去活力的呈现粉红色，无活力或不育的花粉无色[7]。
取载玻片撒少量花粉，滴1～2滴醋酸洋红溶液，染色30 min后显微镜下观察，凡被染成红色的花粉为有活力的花粉，未被染色的花粉为无活力的花粉[8]。
（3）TTC染色测定法。TTC是一种氧化还原染料，水溶液无色。基本原理：当TTC渗入细胞后，遇到活细胞中的脱氢酶接受氢离子，由无色的氧化型变成红色的还原型不溶于水的化合物[9]，以此来判断花粉的生活力。取少量花粉置于载玻片上，加上1滴TTC溶液，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，然后置于35 ℃恒温箱中染色15～20 min。于10×10倍镜下观察，凡具有活力的花粉被染成红色，部分丧失活力的花粉呈现粉红色，无色是无活力或不育的花粉粒。制作3个装片，每片取5个视野，统计其花粉的活力百分率。
1.2.2花粉萌发测定法。
配制蔗糖浓度为5%、10%、15%，硼酸浓度为25、50、75 μg/mL的培养基，pH为6.5，用滴管吸取少量培养基，趁热滴在载玻片上，放置片刻使其凝固，将少量花粉均匀撒播在培养基上。将制好的片子放在垫有甘油湿润滤纸的培养皿内，在25 ℃温箱中培养1～2 d。每片取5个视野，待花粉萌发后置于显微镜下观察并统计发芽率[10]。
1.2.3花粉量的测定。
采集金太阳杏各单株已达气球期、饱满、正常、未开裂的花蕾，分别在4 ℃环境中保存0、4、8 h，各取完整的10朵单花花药放入1.5 mL离心管中，加入较低浓度番红溶液1.0 mL，高速离心机中离心3 min，使花粉粒均匀分布于溶液，用移液器吸取1 μL稀释液（每次吸取时要充分振荡）滴于载玻片上，显微镜下观察，统计每滴溶液中花粉粒数，每朵花观察3滴，重复3次[11]，计算每朵花药的花粉量。
每枚花药花粉量=每个载玻片总花粉粒数×1 000/单花花药数[2]
2结果与分析
2.1TTC染色测定金太阳杏花粉活力由表1数据计算得总平均数为11.50%，即TTC染色法测定金太阳杏花粉活力为11.50%。
2.2不同浓度蔗糖、硼酸对花粉萌发花粉管的影响
成熟花粉具有较强的生活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长。花粉的萌发和生长与培养条件、气候、花粉成熟度和植物种类等有关。硼酸对促进花粉萌发和花粉管伸长的作用机理是增加糖的吸收、运转和代谢，形成糖硼酸复合体，增加氧的吸收，并促进花粉管膜成分果胶物质的合成。一般来说，花粉中硼的含量是不足的，而在自然条件下，这种不足是由柱头和花柱内的硼所补偿的。因此，在离体培养时，需要添加适量浓度的硼酸，以促进花粉的萌发和生长。蔗糖对花粉萌发和花粉管的生长具有明显的促进作用，主要有2个方面：一方面为花粉萌发及花粉管的生长提供营养；另一方面维持外界环境一定的渗透压，使花粉壁破裂，内容物吐出，浓度高时又会造成花粉的质壁分离。因此，蔗糖的浓度一定要控制在合理范围内。 由表2可知，在温度25 ℃、pH 6.5、蔗糖浓度10%、硼酸浓度25 μg/mL条件下花粉的萌发率最高，即该条件下花粉活力最好，为27.00%。上述条件下花粉的萌发情况见图1。
2.3金太阳杏花花粉量的测定
取10株单花花药，记录每枚花药花粉量。每朵花取3滴药液，重复3次。由表3数据计算得金太阳杏每枚花药花粉量为1 303。
3讨论
花粉活力测定方法中，染色法较简单、快速，在一定程度上可以直接反映花粉活力，但是受花粉活性的影响，不能直接表现花粉的萌发率。例如，碘-碘化钾染色法测定花粉活力时有的发育不良、畸形的花粉中也有积累的淀粉，用碘-碘化钾溶液染色时，也出现蓝色从而使测量结果偏大，并且该方法不适合淀粉含量低的花粉，如菊属植物[10]。另外，该速测方法也在刚竹属[11]、水稻[12]、苜蓿[13]、辣椒[14]等的花粉速测上得到应用。TTC染色法虽然适用范围很广，一般用于葫芦科[15]、当归[16]、番木瓜[17]、连翘[18]、人心果[19]、一串红[20]、
月季[21]等花粉活力的检测，但是染色后的花粉颜色差别小，有活力的花粉边缘被染成红色，中间呈现黄褐色，而无活力的花粉整个呈现黄褐色，在显微镜下不易分辨。醋酸洋红染色法在苎麻[2]、西葫芦[15]、鸢尾属[22]等花粉活力测定上效果不理想，但在澳洲坚果[23]、胡萝卜[24]、马铃薯[25]等花粉活力快速检测上得到广泛应用。花粉离体萌发法中，二细胞型花粉一般在仅含蔗糖和硼酸的基本培养基上培养即可萌发，但三细胞型花粉则需加入其他元素，如十字花科、菊科、禾本科。在基本培养基中加入聚乙二烯（PEG）也可明显提高花粉的萌发率[26]。
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