论文部分内容阅读
摘要：通过对谷氨酸提取液和椰子水的组成成份分析，研究了原料浓度、发酵培养基的组成、发酵时间对细菌纤维素的影响。在采用相同工艺条件时，谷氨酸提取液代替椰子水生产细菌纤维素，生产周期基本相同，虽然产量稍低，但生产成本大大降低。
关键词：谷氨酸提取液 椰子水 细菌纤维素
随着人们对均衡营养认识的提高以及膳食纤维作为第七大营养素的独特功效，作为膳食纤维的细菌纤维素的系列产品将具有非常广阔的市场前景。细菌纤维素全部由葡萄糖苷键和氢键连接而成，化学结构式中含有大量的羟基基团，易于改性和表面修饰，具有良好的发展潜力。
谷氨酸提取液是味精生产中发酵液提取谷氨酸后的上清液，目前味精厂一般采用离子交换、污水处理达标后排放或制造肥料等进行综合利用，有的甚至直接排废。我国在前几年开始利用被视为废弃物的椰子水生产细菌纤维素，但近年来，椰子水的价格不断上升，造成细菌纤维素的生产成本越来越高。
1．材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌种：木醋杆菌（Acetobacter xylinum），海南亿德食品有限公司提供。
谷氨酸提取液：大米双酶法糖化、高糖流加发酵、等电、离子交换后的上清液，湖南晶鑫味精有限公司提供。
1.1.2椰子水：市售，海南产。
1.2仪器与设备酸度计、FA1104电子天平、高压杀菌锅、切割机、破碎机、恒温培养箱、真空灌装机。
1.3培养基的组成
斜面培养基：胰蛋白胨0.5%，酵母浸出汁0.5%，柠檬酸0.12%，葡萄糖2.0%，K2HPO40.5%，pH6.0。
种子培养基同斜面培养基，但不加琼脂。
1.4操作要点
1.4.1使用过的塑料盘浸在10%的漂白粉溶液中清洗、新塑料盘用水直接冲洗干净，倒扣干燥后采用KDA气雾剂杀菌。
1.4.2报纸根据浅盘的大小裁成小片、培养基、玻璃器皿等均采用121℃、20min杀菌。
1.4.3取一环活化好的斜面种子接入种子培养基，30℃恒温培养3～4d，按3%～5%的接种量接入发酵培养基，发酵培养基的厚度为1.2～2.0cm，起始pH值为3.8～4.0，静态发酵温度为28～32℃。
1.5分析方法
1.5.1总糖、还原糖：3，5-二硝基水杨酸比色法，蛋白质：凯氏定氮法，氨基酸：茚三酮比色法，灰分：燃烧、称重法，pH值：酸度计。
1.5.2纤维素测定方法将已培养成片状的纤维素收集后用水冲洗干净，然后切成小块悬浮在4%的NaOH溶液中，100℃煮沸20min后用去离子水多次冲洗，再用0.5%的醋酸中和，最后用去离子水冲洗干净。在80℃干燥12～18h，冷却到室温后称重。
2．结果与讨论
2.1原料成分分析
表1：椰子水成分测定结果
表2：谷氨酸提取液测定结果
表1、表2的分析结果表明，椰子水中的总糖含量高于谷氨酸提取液，但谷氨酸提取液中氨基酸、有机酸、铵离子等的含量则要远远高于椰子水中的含量。
2.2原料浓度对细菌纤维素的影响
谷氨酸提取液如不进行综合利用，则一般只会当作废水直接排放，因此，无需考虑经济效益就可以直接利用。而目前椰子水的价格约为800元/t，因此，生产中必需要考虑原料的生产成本。不同椰子水浓度对细菌纤维素发酵的影响结果见表3。
表3：椰子水浓度对发酵的影响
随着椰子水浓度的增加，发酵基质的缓冲能力增加，细菌纤维素的厚度增长、产量增加。从表3可知，椰子水的含量在70%以上时，细菌纤维素的产量、质量差异不大。但椰子水的浓度越高，纤维素的产量越大，故本研究以70%的椰子水作为发酵培养基，同直接用谷氨酸提取液作为培养基进行比较。
2.3发酵培养基的选择
谷氨酸提取液中含有残糖0.5%，总糖1.0%，乳酸琥珀酸等有机酸0.8%，酮酸0.06%，铵离子0.6%～0.8%，还含有核酸和核苷酸类物质、腺嘌呤化合物、尿嘧啶化合物，残留的消泡剂和其它培养基杂质，残留的阴离子：SO42-、Cl-、PO43-，残留的阳离子：K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+等。[1]这些物质未能被谷氨酸菌利用，或者是谷氨酸发酵过程中的副产物，但大多能被木醋杆菌利用生产细菌纤维素。因为木醋杆菌可利用多种碳源来合成纤维素，包括已糖及它们相对应的酸如葡萄糖酸，化合物如丙酮酸、甘油、二羟丙酮、TCA循环的中间产物如琥珀酸等，但不能直接利用淀粉作为碳源。[2]培养基的组成见表4。
表4：谷氨酸提取液和椰子水发酵培养基的组成
碳源是构成细胞和细菌纤维素的碳架及能量来源，常见的大都为糖类物质。针对木醋杆菌的生长特征以及细菌纤维素生物合成的要求，可选择葡萄糖、果糖、蔗糖等作为碳源。合适的氮源有利于细胞生长，可选择的有机氮有：牛肉膏、蛋白胨和酵母粉；无机氮有：硫酸铵、尿素、氯化铵和硝酸钠。磷是构成菌体中核酸的重要元素，也是辅酶的组成成分之一，在能量转变过程中起着关键作用。K+、Mg2+是细胞中许多酶的激活剂，一般选择K2HPO4、Na2HPO4、KH2PO4和MgSO4。[3]
从表4可知，谷氨酸提取液发酵培养基中添加玉米浆补充氮源及生长因子，但无需添加无机盐和有机酸调节pH值，而椰子水则添加硫酸铵补充氮源、添加柠檬酸调节pH值。柠檬酸浓度在0.2%时，细菌纤维素产量得到明显提高，因为柠檬酸可以参加TCA循环，在细胞生长早期，柠檬酸可促进代谢流从纤维素合成转向TCA循环，产生更多能量，加速细胞生长，从而提高了整体纤维素的产量。[4]考虑到蔗糖廉价易得，用于生产细菌纤维素时的产量也较高，故两种培养基均选用蔗糖;同时，在两种培养基中均加入KH2PO4以补充磷。
2.4培养周期的选择
在使用谷氨酸提取液作为发酵培养基时，木醋杆菌静止培养2d后表面开始出现薄膜，3d后开始快速增厚，6d后增速减慢，8～9d后基本停止，一般10d时可以收获，结果见表5。
表5：谷氨酸提取液发酵培养基在不同发酵时间的细菌纤维素产量
使用椰子水发酵培养基时，第3天pH值陡然下降，以后趋于稳定，细菌纤维素的产量增加，5～6d后增速减慢，7d时pH值达到新的最大值，然后逐步降低，一般在8～10d时可以收获，结果见表6。
表6：椰子水发酵培养基在不同发酵时间的细菌纤维素产量
由表5、表6可知，木醋杆菌首先将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，造成培养基pH值下降，使菌体生长受到抑制，因此纤维素产量较低。蔗糖的水解产物为葡萄糖和果糖，在以蔗糖为主要碳源时会有少量葡萄糖酸形成，随着培养时间延长，许多葡萄糖酸又可以转化成纤维素及其它代谢产物，pH值逐渐回升。延长发酵时间，细菌纤维素的产量也不再提高，因为此时培养基的pH值比较低，而且大量的副产物的产生抑制细菌纤维素的生成。[5]
结论
（1）由于谷氨酸提取液中含有大量的糖类、铵离子、有机酸、矿物质等未能被谷氨酸菌利用或不能利用的物质，而这些物质大多可以被木醋杆菌直接利用生产细菌纤维素，只需添加糖类补充碳源、添加玉米浆补充氮源和生长因子、添加KH2PO4补充磷，而无需添加有机酸调节pH值就可以生产细菌纤维素。
（2）根据谷氨酸提取液的组成特点改变培养基质，在相同生产工艺条件下，利用谷氨酸提取液代替椰子水生产细菌纤维素时，发酵时间基本一致，虽然产量低于椰子水的生产，但生产成本大大降低，重要的是为谷氨酸提取液的综合利用开辟了一条新路。
参考文献
[1]于信令主编，味精工业手册[M]，北京：中国轻工业出版社，1995.292
[2]D.Byrom.Microbial Cellulose,Biometerials[M].1991，263～283
[3]陈坚，堵国成等，微生物重要代谢产物-发酵生产与过程解析[M]，北京：化学工业出版社，2005.83～89
[4] 张凤清，张海悦，玉米浆做Acetobacter xylinum培养基生产纤维素的发酵条件优化[J]，食品工业科技，2005（2）：108
[5]马霞，王瑞明等，糖源对细菌纤维素产量的影响[J]，纤维素科学与技术，2002.10（3）：32
基金项目：湖南省教育厅高校科研项目（NO.05D032）
作者简介：赵克勤（1963-）男, 副教授, 主要从事食品生物技术的教学和科研工作。
关键词：谷氨酸提取液 椰子水 细菌纤维素
随着人们对均衡营养认识的提高以及膳食纤维作为第七大营养素的独特功效，作为膳食纤维的细菌纤维素的系列产品将具有非常广阔的市场前景。细菌纤维素全部由葡萄糖苷键和氢键连接而成，化学结构式中含有大量的羟基基团，易于改性和表面修饰，具有良好的发展潜力。
谷氨酸提取液是味精生产中发酵液提取谷氨酸后的上清液，目前味精厂一般采用离子交换、污水处理达标后排放或制造肥料等进行综合利用，有的甚至直接排废。我国在前几年开始利用被视为废弃物的椰子水生产细菌纤维素，但近年来，椰子水的价格不断上升，造成细菌纤维素的生产成本越来越高。
1．材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌种：木醋杆菌（Acetobacter xylinum），海南亿德食品有限公司提供。
谷氨酸提取液：大米双酶法糖化、高糖流加发酵、等电、离子交换后的上清液，湖南晶鑫味精有限公司提供。
1.1.2椰子水：市售，海南产。
1.2仪器与设备酸度计、FA1104电子天平、高压杀菌锅、切割机、破碎机、恒温培养箱、真空灌装机。
1.3培养基的组成
斜面培养基：胰蛋白胨0.5%，酵母浸出汁0.5%，柠檬酸0.12%，葡萄糖2.0%，K2HPO40.5%，pH6.0。
种子培养基同斜面培养基，但不加琼脂。
1.4操作要点
1.4.1使用过的塑料盘浸在10%的漂白粉溶液中清洗、新塑料盘用水直接冲洗干净，倒扣干燥后采用KDA气雾剂杀菌。
1.4.2报纸根据浅盘的大小裁成小片、培养基、玻璃器皿等均采用121℃、20min杀菌。
1.4.3取一环活化好的斜面种子接入种子培养基，30℃恒温培养3～4d，按3%～5%的接种量接入发酵培养基，发酵培养基的厚度为1.2～2.0cm，起始pH值为3.8～4.0，静态发酵温度为28～32℃。
1.5分析方法
1.5.1总糖、还原糖：3，5-二硝基水杨酸比色法，蛋白质：凯氏定氮法，氨基酸：茚三酮比色法，灰分：燃烧、称重法，pH值：酸度计。
1.5.2纤维素测定方法将已培养成片状的纤维素收集后用水冲洗干净，然后切成小块悬浮在4%的NaOH溶液中，100℃煮沸20min后用去离子水多次冲洗，再用0.5%的醋酸中和，最后用去离子水冲洗干净。在80℃干燥12～18h，冷却到室温后称重。
2．结果与讨论
2.1原料成分分析
表1：椰子水成分测定结果
表2：谷氨酸提取液测定结果
表1、表2的分析结果表明，椰子水中的总糖含量高于谷氨酸提取液，但谷氨酸提取液中氨基酸、有机酸、铵离子等的含量则要远远高于椰子水中的含量。
2.2原料浓度对细菌纤维素的影响
谷氨酸提取液如不进行综合利用，则一般只会当作废水直接排放，因此，无需考虑经济效益就可以直接利用。而目前椰子水的价格约为800元/t，因此，生产中必需要考虑原料的生产成本。不同椰子水浓度对细菌纤维素发酵的影响结果见表3。
表3：椰子水浓度对发酵的影响
随着椰子水浓度的增加，发酵基质的缓冲能力增加，细菌纤维素的厚度增长、产量增加。从表3可知，椰子水的含量在70%以上时，细菌纤维素的产量、质量差异不大。但椰子水的浓度越高，纤维素的产量越大，故本研究以70%的椰子水作为发酵培养基，同直接用谷氨酸提取液作为培养基进行比较。
2.3发酵培养基的选择
谷氨酸提取液中含有残糖0.5%，总糖1.0%，乳酸琥珀酸等有机酸0.8%，酮酸0.06%，铵离子0.6%～0.8%，还含有核酸和核苷酸类物质、腺嘌呤化合物、尿嘧啶化合物，残留的消泡剂和其它培养基杂质，残留的阴离子：SO42-、Cl-、PO43-，残留的阳离子：K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+等。[1]这些物质未能被谷氨酸菌利用，或者是谷氨酸发酵过程中的副产物，但大多能被木醋杆菌利用生产细菌纤维素。因为木醋杆菌可利用多种碳源来合成纤维素，包括已糖及它们相对应的酸如葡萄糖酸，化合物如丙酮酸、甘油、二羟丙酮、TCA循环的中间产物如琥珀酸等，但不能直接利用淀粉作为碳源。[2]培养基的组成见表4。
表4：谷氨酸提取液和椰子水发酵培养基的组成
碳源是构成细胞和细菌纤维素的碳架及能量来源，常见的大都为糖类物质。针对木醋杆菌的生长特征以及细菌纤维素生物合成的要求，可选择葡萄糖、果糖、蔗糖等作为碳源。合适的氮源有利于细胞生长，可选择的有机氮有：牛肉膏、蛋白胨和酵母粉；无机氮有：硫酸铵、尿素、氯化铵和硝酸钠。磷是构成菌体中核酸的重要元素，也是辅酶的组成成分之一，在能量转变过程中起着关键作用。K+、Mg2+是细胞中许多酶的激活剂，一般选择K2HPO4、Na2HPO4、KH2PO4和MgSO4。[3]
从表4可知，谷氨酸提取液发酵培养基中添加玉米浆补充氮源及生长因子，但无需添加无机盐和有机酸调节pH值，而椰子水则添加硫酸铵补充氮源、添加柠檬酸调节pH值。柠檬酸浓度在0.2%时，细菌纤维素产量得到明显提高，因为柠檬酸可以参加TCA循环，在细胞生长早期，柠檬酸可促进代谢流从纤维素合成转向TCA循环，产生更多能量，加速细胞生长，从而提高了整体纤维素的产量。[4]考虑到蔗糖廉价易得，用于生产细菌纤维素时的产量也较高，故两种培养基均选用蔗糖;同时，在两种培养基中均加入KH2PO4以补充磷。
2.4培养周期的选择
在使用谷氨酸提取液作为发酵培养基时，木醋杆菌静止培养2d后表面开始出现薄膜，3d后开始快速增厚，6d后增速减慢，8～9d后基本停止，一般10d时可以收获，结果见表5。
表5：谷氨酸提取液发酵培养基在不同发酵时间的细菌纤维素产量
使用椰子水发酵培养基时，第3天pH值陡然下降，以后趋于稳定，细菌纤维素的产量增加，5～6d后增速减慢，7d时pH值达到新的最大值，然后逐步降低，一般在8～10d时可以收获，结果见表6。
表6：椰子水发酵培养基在不同发酵时间的细菌纤维素产量
由表5、表6可知，木醋杆菌首先将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，造成培养基pH值下降，使菌体生长受到抑制，因此纤维素产量较低。蔗糖的水解产物为葡萄糖和果糖，在以蔗糖为主要碳源时会有少量葡萄糖酸形成，随着培养时间延长，许多葡萄糖酸又可以转化成纤维素及其它代谢产物，pH值逐渐回升。延长发酵时间，细菌纤维素的产量也不再提高，因为此时培养基的pH值比较低，而且大量的副产物的产生抑制细菌纤维素的生成。[5]
结论
（1）由于谷氨酸提取液中含有大量的糖类、铵离子、有机酸、矿物质等未能被谷氨酸菌利用或不能利用的物质，而这些物质大多可以被木醋杆菌直接利用生产细菌纤维素，只需添加糖类补充碳源、添加玉米浆补充氮源和生长因子、添加KH2PO4补充磷，而无需添加有机酸调节pH值就可以生产细菌纤维素。
（2）根据谷氨酸提取液的组成特点改变培养基质，在相同生产工艺条件下，利用谷氨酸提取液代替椰子水生产细菌纤维素时，发酵时间基本一致，虽然产量低于椰子水的生产，但生产成本大大降低，重要的是为谷氨酸提取液的综合利用开辟了一条新路。
参考文献
[1]于信令主编，味精工业手册[M]，北京：中国轻工业出版社，1995.292
[2]D.Byrom.Microbial Cellulose,Biometerials[M].1991，263～283
[3]陈坚，堵国成等，微生物重要代谢产物-发酵生产与过程解析[M]，北京：化学工业出版社，2005.83～89
[4] 张凤清，张海悦，玉米浆做Acetobacter xylinum培养基生产纤维素的发酵条件优化[J]，食品工业科技，2005（2）：108
[5]马霞，王瑞明等，糖源对细菌纤维素产量的影响[J]，纤维素科学与技术，2002.10（3）：32
基金项目：湖南省教育厅高校科研项目（NO.05D032）
作者简介：赵克勤（1963-）男, 副教授, 主要从事食品生物技术的教学和科研工作。