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摘要：【目的】探究慢性氨氮脅迫对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生理生化和血蓝蛋白基因表达的影响，明确氨氮胁迫的毒性作用，为养殖户在对虾中后期健康养殖管理上提供技术参考，同时丰富凡纳滨对虾的毒理研究资料。【方法】挑选540尾平均初始湿体重9.92±0.24 g/尾的健康凡纳滨对虾，随机分成6个组，每组设3个重复，暴露于不同氨氮浓度[0（对照）、4、6、8、12和16 mg/L]的曝气自来水中，分别于胁迫16、17、18、19和20 d时取样测定凡纳滨对虾的血淋巴氨氮、尿素氮及血蓝蛋白含量，胁迫结束后统计凡纳滨对虾的体长增长率、体重增长率和存活率，同时取鳃组织和肝胰腺制作石蜡切片。【结果】慢性氨氮胁迫16～20 d，各胁迫处理组凡纳滨对虾的存活率、体重增长率和体长增长率均随氨氮浓度的增加而依次降低，且显著低于对照组凡纳滨对虾（P<0.05，下同）。随着氨氮胁迫时间的延长，各胁迫处理组凡纳滨对虾血淋巴氨氮和尿素氮含量均明显高于对照组凡纳滨对虾，且二者的变化趋势基本一致;各胁迫处理组凡纳滨对虾血蓝蛋白含量均显著低于对照组凡纳滨对虾，且血蓝蛋白含量的变化趋势总体上与水体氨氮浓度呈负相关，血蓝蛋白基因的表达水平与血蓝蛋白含量变化趋势基本相符，总体上表现为氨氮胁迫时间越长，凡纳滨对虾血蓝蛋白基因的相对表达量越低。经慢性氨氮胁迫后凡纳滨对虾鳃组织和肝胰腺严重受损，鳃丝肿胀，核固缩，血淋巴细胞增多，局部空泡化、结构不完整，鳃呼吸上皮细胞大面积脱落;胰腺管肿大，空泡化严重，肝小管排列紊乱，管腔扩大，边界模糊，肝小管间隙和管腔中可观察到破碎的细胞组织。【结论】慢性氨氮胁迫对凡纳滨对虾的生长及生存有明显影响，造成血淋巴氨氮和尿素氮含量增加，并下调血蓝蛋白基因表达及阻碍血蓝蛋白合成，凡纳滨对虾的鳃组织和肝胰腺严重受损。即慢性氨氮胁迫引起的呼吸功能障碍及肝胰腺代谢功能紊乱，是导致凡纳滨对虾应激死亡的主要原因。
关键词： 凡纳滨对虾;慢性氨氮胁迫;尿素氮;血蓝蛋白;组织损伤
中图分类号： S9117.4 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-1098-10
Effects of chronic ammonia nitrogen stress on physiology and biochemistry indexes and hemocyanin gene expression of Litopenaeus vannamei
GU Nan1，2，3， DAI Xi-lin1，2，3*
（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Key Lad of Freshwater Aquatic Germplasm Resources of Ministry of Agriculture and Rural Affairs （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 3Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal
Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China）
Abstract：【Objective】To investigate the effects of chronic ammonia nitrogen stress on the physiology， biochemistry and expression of hemocyanin gene of Litopenaeus vannamei，clarify the toxic effect of ammonia nitrogen stress，and provide reference for farmers in the middle and late stage of healthy culture management of shrimp， and enrich the toxicological research data of L. vannamei at the same time. 【Method】540 healthy L. vannamei with an average initial wet body weight of 9.92±0.24 g per shrimp were randomly divided into 6 groups， each group was set with 3 replicates，each of which was exposed to aerated tap water at different ammonia nitrogen concentrations（0， 4， 6， 8， 12 and 16 mg/L）. Samples were taken at 16， 17， 18， 19 and 20 d to determine the contents of ammonia nitrogen， urea nitrogen and hemocyanin of L. vannamei， respectively. After the stress， the growth rate of body length， the rate of weight gain and the survival rate were counted. At the same time， the gill tissue and hepatopancreas were taken for paraffin section. 【Result】From 16 to 20 d of chronic ammonia nitrogen stress， the survival rate，the growth rate of weight gain and body length of L. vannamei in each stress group decreased in turn with the increase of ammonia nitrogen concentration，and significantly lower than that of the control group（P<0.05，the same below）. With the prolongation of ammonia nitrogen stress time， ammonia nitrogen and urea nitrogen in hemolymph of each stress group were higher than those of the control group，and the change trend of the two was basically consistent; the content of hemocyanin in each stress group was significantly lower than that of the control group，and the variation trend of hemocyanin content was negatively correlated with the concentration of ammonia nitrogen in water，the expression of hemocyanin gene was basically consistent with the change trend of hemocyanin content， which generally showed that the longer ammonia-nitrogen stress time was， the lower the relative expression level of hemocyanin gene was. After chronic ammonia nitrogen stress， the gill tissue and hepatopancreas of L. vannamei were ser-iously damaged， including gill filament swelling， nuclear pyknosis， increased blood lymphocytes， local vacuolation and incomplete structure， and large area of gill respiratory epithelial cells were exfoliated. Pancreatic ducts were enlarged with severe vacuolization， hepatic tubules were arranged disorderly， lumen was enlarged and the boundary was blurred， and broken cells and tissues could be observed in the space between the hepatic tubules and lumen. 【Conclusion】Chronic ammonia nitrogen stress has a great inhibition on the growth and survival rate of L. vanname. It will increase the content of ammonia nitrogen and urea nitrogen in hemolymph， decrease the relative expression level of hemocyanin mRNA， block the synthesis of hemocyanin，and cause serious damage to gill and hepatopancreas. Respiratory dysfunction and hepatopancreas metabolic dysfunction caused by chronic ammo nianitrogen stress are the main causes of stress death of L. vannamei. Key words： Litopenaeus vannamei; chronic ammonia nitrogen stress; urea nitrogen; hemocyanin; tissue damage
Foundation item： Shanghai Shrimp Industry Technology System Construction Special Project（HNKGZ〔2014〕7-1-11）
0 引言
【研究意義】凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）因具有生长速度快、抗逆性强，可适应不同盐度、温度及养殖密度环境，以及肉质鲜美、食用率高等特点，在我国沿海地区已广泛养殖，且在内陆省份己成功进行人工养殖（张彬等，2014;邱立国，2017）。在高度集约化养殖模式下，养殖水体极易出现氨氮过量积累，进而对凡纳滨对虾的生长、蜕壳、渗透调节、免疫及排泄等生理活动产生重要影响（孙健，2017;范鹏程等，2019;熊大林等，2020）。氨氮是集约化水产养殖环境中普遍存在的有害因子，因此探究慢性氨氮胁迫对凡纳滨对虾的影响，对促进我国对虾养殖产业高质量发展具有重要意义。【前人研究进展】至今，有关氨氮胁迫对水生动物的影响已有较多研究报道。在生理生化方面，氨氮胁迫会显著影响日本沼虾（Macrobrachium nipponense）血淋巴中的生化指标（王国江，2008），可导致红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）的血细胞总数下降（潘训彬等，2017），对中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）的血淋巴氨氮含量、尿素氮含量及抗氧化能力造成显著影响（王芸等，2017），还会影响拟穴青蟹（Scylla paramamosain）的血清免疫酶活力（彭军辉等，2018）。在生长性能方面，氨氮胁迫对水生动物的摄食、消化及生长均会产生不利影响（崔平和强俊，2018;胡炜等，2018;唐首杰等，2019）。在器官组织病理变化方面，氨氮胁迫通过损伤水生动物的鳃组织及肝胰腺显微结构，致使机体的抗氧化系统和非特异性免疫系统下降，呼吸功能及正常生理代谢受阻，进而引起机体新陈代谢和解毒功能下降（许星鸿等，2014;王贞杰等，2017;陈思涵等，2018）。在基因表达方面，受氨氮胁迫后中国对虾通过调控HSP90基因来保护细胞（王芸等，2013），尼罗罗非鱼通过调控鳃组织、肝脏和肾脏中的不同氨代谢基因共同参与调节氨代谢而提高机体对氨氮的耐受性（吴俊伟等，2016），大弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris）的TNF、IL-1、IL-6和IL-8等炎性反应相关基因表达量持续升高，故推测过度炎性应激可能是导致鱼类氨中毒死亡的主要原因之一（宋美泽等，2018）。【本研究切入点】目前，国内外有关氨氮胁迫凡纳滨对虾的影响研究主要属于急性胁迫，胁迫时间较短，且对虾规格较小，研究结果适用于养殖前期的凡纳滨对虾，而针对中等规格以上凡纳滨对虾长时间处于氨氮胁迫下的毒性试验较少。【拟解决的关键问题】从对虾生长发育、存活率、生理生化指标、鳃组织和肝胰腺显微结构及血蓝蛋白基因相对表达水平等方面综合探究凡纳滨对虾对氨氮胁迫的响应，明确氨氮胁迫对凡纳滨对虾的毒性作用，以期为养殖户在对虾中后期健康养殖管理上提供技术参考，同时丰富凡纳滨对虾的毒理研究资料。
1 材料与方法
1. 1 试验动物
供试凡纳滨对虾取自上海良星水稻种植专业合作社，在盐度2‰且提前曝气2 d的自来水中驯养1周;然后饲养于水泥池中，池水深度1 m。整个试验周期的养殖水体盐度2‰，水温（27.0±1.1）℃，pH 7.60±0.08，气泡石24 h充氧。最初投饵量为初始体重的1.5%，每天投喂3次，并根据摄食情况及时调整投饵量。
1. 2 试验设计
挑选540尾平均初始湿体重9.92±0.24 g/尾的健康凡纳滨对虾，随机分成6组，每组设3个重复，每个重复30尾对虾，分别暴露于不同氨氮浓度（0、4、6、8、12和16 mg/L）的曝气自来水中，胁迫周期20 d。以0 mg/L氨氮浓度为对照。参照孙国铭等（2002）的方法确定氨氮浓度，并根据预试验结果进行适度调整。
1. 3 养殖水体氨氮浓度测定
养殖水体氨氮浓度测定采用纳氏试剂法（王华等，2013），每天测定2次，使用氯化铵调整水体氨氮浓度达稳定状态。根据温度、pH、盐度、总氨氮浓度换算养殖水体分子氨浓度（王琨和韩英，2007）。
1. 4 样品采集及指标测定
分别于胁迫16、17、18、19和20 d时，各胁迫处理组随机选取凡纳滨对虾3尾，采用一次性1.0 mL无菌注射器吸取抗凝剂于凡纳滨对虾头胸甲后缘插入围心窦内抽取血淋巴样品，将抽取的血淋巴样品混匀，用于测定凡纳滨对虾的血淋巴氨氮、尿素氮及血蓝蛋白含量。胁迫16和20 d时随机取样置于冰盘内，剖解取出肝胰脏，去除多余组织，以预冷超纯水洗净，滤纸吸干后置于装有RNA Keeper的1.5 mL离心管中，-80 ℃超低温保存备用。胁迫结束后统计凡纳滨对虾的体长增长率、体重增长率和存活率;同时取鳃组织和肝胰脏制作石蜡切片，用于观察其显微结构的损伤情况。
1. 4. 1 生长指标及存活率计算
体长增长率（%）=（终末体长-初始体长）/初始
体长×100
体重增长率（%）=（终末体重-初始体重）/初始
体重×100
存活率（%）=存活数/初始总数×100
1. 4. 2 血淋巴氨氮尿素氮含量测定 采用南京建成生物工程研究所研发的血氨测定试剂盒和尿素氮测试盒进行血淋巴氨氮和尿素氮含量测定。
1. 4. 3 血蓝蛋白含量测定 采用紫外吸收法测定血蓝蛋白含量，将抽取的血淋巴样品稀释至1%，移液枪吸取0.04 mL血淋巴稀释液，以紫外分光光度计在334 nm波长处测定吸光值，参照王顺昌和许立（2003）的方法换算血蓝蛋白含量。 血蓝蛋白含量（mmol/L）=2.69E[1%1 cm]
式中，E[1%1 cm]表示1%血淋巴稀釋液在光径为1 cm石英比色皿中的吸光值。
1. 4. 4 血蓝蛋白基因表达水平测定 采用UNIQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒（B511321）抽提样品RNA，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测是否存在基因组污染，并使用核酸定量仪检测RNA浓度及纯度。将RNA反转录成cDNA，并根据凡纳滨对虾血蓝蛋白cDNA序列，以Primer Premier 5.0设计实时荧光定量PCR扩增特异性引物（表1），引物合成和cDNA样品测序均委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。完成实时荧光定量PCR检测后，采用2-△△Ct法换算凡纳滨对虾血蓝蛋白基因相对表达量。
1. 4. 5 鳃组织和肝胰腺石蜡切片制作 将鳃组织和肝胰腺放入中性甲醛溶液中固定24 h，以乙醇逐级脱水，石蜡包埋后切片，HE染色，置于生物显微镜（XSP-BM-12CAV）下观察并拍照。
1. 5 统计分析
试验数据采用SPSS 21.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan?s多重比较。
2 结果与分析
2. 1 养殖水体总氨氮与分子氨的浓度变化
上午测定结果（图1-A）显示，对照组（0 mg/L）养殖水体总氨氮浓度维持在0.1～0.6 mg/L，4 mg/L组维持在3.0～5.0 mg/L，6 mg/L组维持在4.7～6.7 mg/L，8 mg/L组维持在6.4～10.2 mg/L，12 mg/L组维持在10.8～14.8 mg/L，16 mg/L组维持在14.3～16.5 mg/L。下午调整养殖水体氨氮浓度后的测定结果（图1-B）显示，对照组（0 mg/L）养殖水体总氨氮浓度维持在0.1～0.3 mg/L，4 mg/L组维持在3.1～4.7 mg/L，6 mg/L组维持在5.3～6.6 mg/L，8 mg/L组维持在7.1～8.8 mg/L，12 mg/L组维持在11.3～13.8 mg/L，16 mg/L组维持在15.1～16.7 mg/L。
上午测定结果（图2-A）显示，对照组（0 mg/L）养殖水体分子氨浓度维持在0.00～0.02 mg/L，4 mg/L组维持在0.07～0.12 mg/L，6 mg/L组维持在0.11～0.16 mg/L，8 mg/L组维持在0.15～0.24 mg/L，12 mg/L组维持在0.25～0.33 mg/L，16 mg/L组维持在0.34～0.39 mg/L。下午调整养殖水体氨氮浓度后的测定结果（图2-B）显示，对照组（0 mg/L）养殖水体分子氨浓度维持在0.00～0.01 mg/L，4 mg/L组维持在0.08～0.11 mg/L，6 mg/L组维持在0.13～0.16 mg/L，8 mg/L组维持在0.17～0.21 mg/L，12 mg/L组维持在0.27～0.31 mg/L，16 mg/L组维持在0.36～0.39 mg/L。
2. 2 凡纳滨对虾的存活率及其生长状况
由表2可知，胁迫15 d后各胁迫处理组凡纳滨对虾存活率随氨氮浓度的增加而逐渐降低，且各胁迫处理组间差异显著（P<0.05，下同）;至胁迫20 d，各胁迫处理组凡纳滨对虾存活率均随胁迫时间的延长继续降低，且显著低于对照组凡纳滨对虾的存活率，随氨氮浓度的增加凡纳滨对虾存活率依次降低。可见，慢性氨氮胁迫下凡纳滨对虾的生存受到显著抑制，且氨氮浓度越高影响越大。由表3可知，胁迫20 d后各胁迫处理组凡纳滨对虾的体重增长率和体长增长率均随氨氮浓度的增加依次降低，且各胁迫处理组间差异显著，说明慢性氨氮胁迫下凡纳滨对虾的生长也受到显著影响。
2. 3 凡纳滨对虾血淋巴氨氮及尿素氮含量的变化
由图3可看出，胁迫15 d后各胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量均明显高于对照组凡纳滨对虾。胁迫16 d时，除4 mg/L组外，其他胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量均显著高于对照组凡纳滨对虾;胁迫17 d时，8、12和16 mg/L组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量显著高于对照组凡纳滨对虾，且以8 mg/L组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量最高;胁迫18 d时也表现为除4 mg/L组外，其他胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量均显著高于对照组凡纳滨对虾，以16 mg/L组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量最高;胁迫19和20 d后，各胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量均显著高于对照组凡纳滨对虾。在血淋巴尿素氮含量方面，各胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量均随氨氮胁迫时间的延长呈先升高后降低的变化趋势，且总体上与水体氨氮浓度呈正相关，高浓度（12和16 mg/L）胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量显著高于对照组凡纳滨对虾（图4）。胁迫18 d时，8、12和16 mg/L组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量显著高于对照组凡纳滨对虾，且各胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量均达最高值，与凡纳滨对虾血淋巴氨氮含量的变化趋势基本吻合;至胁迫20 d时，除4 mg/L组外，其他胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量均显著高于对照组凡纳滨对虾。
2. 4 凡纳滨对虾血蓝蛋白含量的变化
由图5可看出，经氨氮胁迫15 d后，各胁迫处理组凡纳滨对虾血蓝蛋白含量均显著低于对照组凡纳滨对虾，且凡纳滨对虾血蓝蛋白含量的变化趋势总体上与水体氨氮浓度呈负相关，表明凡纳滨对虾在长期的氨氮胁迫下其蛋白合成代谢受阻，进而影响血蓝蛋白的合成。血蓝蛋白是含铜的呼吸蛋白，凡纳滨对虾血蓝蛋白含量降低可能会影响其呼吸作用。
2. 5 凡纳滨对虾血蓝蛋白基因表达水平的变化
由图6可知，胁迫15和20 d时各胁迫处理组凡纳滨对虾血蓝蛋白基因的相对表达量均显著低于对照组凡纳滨对虾，且总体上表现为氨氮胁迫时间越长，各胁迫处理组凡纳滨对虾血蓝蛋白基因的相对表达量越低，表明血蓝蛋白基因表达受慢性氨氮胁迫的影响，进而影响血蓝蛋白的合成，以及与血蓝蛋白相关的正常生理功能。 2. 6 凡纳滨对虾鳃组织和肝胰腺显微结构的变化
2. 6. 1 鳃组织的病理变化 由图7可看出，经慢性氨氮胁迫后凡纳滨对虾鳃组织严重受损，鳃呼吸作用及其正常代谢均受到影响，具体病理变化表现为：鳃丝肿胀，核固缩，血淋巴细胞增多，局部空泡化、结构不完整;鳃呼吸上皮细胞大面积脱落，鳃膜碎化，有大量酸性物质分泌，经HE染色呈红色;鳃叶末端的亚几丁质层结构破碎，亚几丁质空间被破坏。
2. 6. 2 肝胰腺的病理变化 由图8可看出，经慢性氨氮胁迫后凡纳滨对虾胰腺管肿大，空泡化严重;星状管腔变形，空泡间的结缔组织被损坏，多个空泡融合为一个大的空泡;肝小管排列紊乱，管腔扩大，边界模糊;肝小管出现破裂，细胞体积增大，细胞大量解体，肝小管间隙和管腔中可观察到破碎的细胞组织。
3 讨论
本研究发现，凡纳滨对虾养殖水体氨氮浓度经每天调整与设计浓度基本一致，偶有升高，其原因可能是剩余饵料及代谢产生的粪便等所引起（吴堃等，2017）。在水体中，氨主要以离子化（NH4+）和非离子化形式（NH3）存在（Dutra et al.，2016），且其浓度变化与水温、盐度及pH均有关（Barbieri，2010;Frisk et al.，2013）。甲壳动物的氨氮排泄也受养殖水体pH影响。于敏等（2007）研究证实，当养殖水体pH≤9.0时，中华绒螯蟹的氨氮排泄变化不明显，但养殖水体pH升高至10.5后，其氨氮排泄急剧下降，且排泄过程具有不连续性。
随着水体NH3含量的升高及胁迫时间的延长，鱼类摄食量开始减少，生长速度减慢，严重者生长开始停滞（唐首杰等，2019）。胡炜等（2018）研究发现，当水体氨氮浓度超过2 mg/L后，刺参的末体重和特定生长率均随氨氮浓度的升高呈显著下降趋势。管敏等（2019）研究表明，在慢性氨氮胁迫下，F2代中华鲟的生长受到显著抑制，其抗氧化能力及免疫能力也同步降低。本研究结果表明，经慢性氨氮胁迫后，凡纳滨对虾的体长增长率、增重增长率和存活率均随氨氮浓度的升高而呈递减趋势，说明氨氮胁迫浓度升高对凡纳缤对虾的生长及生存有明显影响。此外，随着胁迫时间的延长，各胁迫处理组凡纳滨对虾血淋巴氨氮不断积累，至胁迫19和20 d时其含量均显著高于对照组凡纳滨对虾，与王芸等（2017）的研究结果相似，即随着氨氮胁迫时间的延长，中国明对虾血淋巴氨氮含量逐渐积累。甲壳类动物的尿素氮生成主要来源于鸟苷酸循环及尿酸分解，而后者的形成主要源于核苷酸降解。本研究结果表明，慢性氨氮胁迫下凡纳滨对虾血淋巴中的尿素氮和氨氮含量变化趋势基本一致，可能是随着凡纳滨对虾血淋巴氨氮含量的升高，凡纳滨对虾会启动自身的解毒机制，将毒性较强的氨氮转化为相对较弱的尿素氮（于敏等，2008）。
血蓝蛋白是位于节肢动物（螯肢类、甲壳类、多足类和蜘蛛类）和软体动物（腹足类和头足类）血淋巴中的含铜呼吸蛋白，除了具有输氧功能外，还可通过多种方式参与机体免疫防御，是虾蟹等水产养殖动物重要的多功能免疫因子（张泽蕙等，2016;窦全伟，2018）。王国江（2008）研究表明，氨氮和亚硝态氮对日本沼虾血淋巴中的血细胞数量、生理生化指标、酚氧化酶活性及血蓝蛋白含量均产生显著影响。本研究发现，慢性氨氮胁迫15 d后，各胁迫处理组凡纳滨对虾血蓝蛋白含量均显著低于对照组凡纳滨对虾，且凡纳滨对虾血蓝蛋白含量的变化趋势总体上与水体氨氮浓度呈负相关，血蓝蛋白基因的表达水平与血蓝蛋白含量变化趋势基本相符，总体上表现为氨氮胁迫时间越长，凡纳滨对虾血蓝蛋白基因的相对表达量越低。可见，慢性氨氮胁迫通过下调凡纳滨对虾血蓝蛋白基因表达，而阻碍血蓝蛋白合成，进而影响凡纳滨对虾的呼吸功能及免疫功能等，可能是导致其死亡的主要原因。
氨氮是当前水产养殖环境中普遍存在的污染因子，可通过水生动物的鳃组织而渗入其血淋巴中，从而引起血淋巴氨氮含量升高，同时对鳃组织结构造成损伤。鳃组织与外界水环境直接接觸，当水环境中存在不利因子如重金属时，极易对鳃组织造成损伤（王权等，2012）。已有研究表明，长期氨氮胁迫对凡纳滨对虾的鳃组织和肝胰腺均会造成严重损伤（赵卫红等，2014;Liu et al.，2014）。此外，水环境变化会影响甲壳类动物肝胰腺中B细胞和R细胞的组成比例（赵柳兰，2012;韩晓琳等，2014）。本研究结果表明，经慢性氨氮胁迫后凡纳滨对虾鳃组织严重受损，鳃丝肿胀，核固缩，血淋巴细胞增多，局部空泡化、结构不完整，鳃呼吸上皮细胞大面积脱落，有大量酸性物质分泌，鳃叶末端的亚几丁质层结构破碎，亚几丁质空间被破坏;胰腺管肿大，空泡化严重，肝小管排列紊乱，管腔扩大，边界模糊，肝小管间隙和管腔中可观察到破碎的细胞组织。可见，慢性氨氮胁迫引起的呼吸功能障碍及肝胰腺代谢功能紊乱，是导致凡纳滨对虾应激死亡的主要原因。
4 结论
慢性氨氮胁迫对凡纳滨对虾的生长及生存有明显影响，造成血淋巴氨氮和尿素氮含量增加，并下调血蓝蛋白基因表达及阻碍血蓝蛋白合成，凡纳滨对虾的鳃组织和肝胰腺严重受损。即慢性氨氮胁迫引起的呼吸功能障碍及肝胰腺代谢功能紊乱，是导致凡纳滨对虾应激死亡的主要原因。
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（责任编辑 兰宗宝）
关键词： 凡纳滨对虾;慢性氨氮胁迫;尿素氮;血蓝蛋白;组织损伤
中图分类号： S9117.4 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-1098-10
Effects of chronic ammonia nitrogen stress on physiology and biochemistry indexes and hemocyanin gene expression of Litopenaeus vannamei
GU Nan1，2，3， DAI Xi-lin1，2，3*
（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Key Lad of Freshwater Aquatic Germplasm Resources of Ministry of Agriculture and Rural Affairs （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 3Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal
Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China）
Abstract：【Objective】To investigate the effects of chronic ammonia nitrogen stress on the physiology， biochemistry and expression of hemocyanin gene of Litopenaeus vannamei，clarify the toxic effect of ammonia nitrogen stress，and provide reference for farmers in the middle and late stage of healthy culture management of shrimp， and enrich the toxicological research data of L. vannamei at the same time. 【Method】540 healthy L. vannamei with an average initial wet body weight of 9.92±0.24 g per shrimp were randomly divided into 6 groups， each group was set with 3 replicates，each of which was exposed to aerated tap water at different ammonia nitrogen concentrations（0， 4， 6， 8， 12 and 16 mg/L）. Samples were taken at 16， 17， 18， 19 and 20 d to determine the contents of ammonia nitrogen， urea nitrogen and hemocyanin of L. vannamei， respectively. After the stress， the growth rate of body length， the rate of weight gain and the survival rate were counted. At the same time， the gill tissue and hepatopancreas were taken for paraffin section. 【Result】From 16 to 20 d of chronic ammonia nitrogen stress， the survival rate，the growth rate of weight gain and body length of L. vannamei in each stress group decreased in turn with the increase of ammonia nitrogen concentration，and significantly lower than that of the control group（P<0.05，the same below）. With the prolongation of ammonia nitrogen stress time， ammonia nitrogen and urea nitrogen in hemolymph of each stress group were higher than those of the control group，and the change trend of the two was basically consistent; the content of hemocyanin in each stress group was significantly lower than that of the control group，and the variation trend of hemocyanin content was negatively correlated with the concentration of ammonia nitrogen in water，the expression of hemocyanin gene was basically consistent with the change trend of hemocyanin content， which generally showed that the longer ammonia-nitrogen stress time was， the lower the relative expression level of hemocyanin gene was. After chronic ammonia nitrogen stress， the gill tissue and hepatopancreas of L. vannamei were ser-iously damaged， including gill filament swelling， nuclear pyknosis， increased blood lymphocytes， local vacuolation and incomplete structure， and large area of gill respiratory epithelial cells were exfoliated. Pancreatic ducts were enlarged with severe vacuolization， hepatic tubules were arranged disorderly， lumen was enlarged and the boundary was blurred， and broken cells and tissues could be observed in the space between the hepatic tubules and lumen. 【Conclusion】Chronic ammonia nitrogen stress has a great inhibition on the growth and survival rate of L. vanname. It will increase the content of ammonia nitrogen and urea nitrogen in hemolymph， decrease the relative expression level of hemocyanin mRNA， block the synthesis of hemocyanin，and cause serious damage to gill and hepatopancreas. Respiratory dysfunction and hepatopancreas metabolic dysfunction caused by chronic ammo nianitrogen stress are the main causes of stress death of L. vannamei. Key words： Litopenaeus vannamei; chronic ammonia nitrogen stress; urea nitrogen; hemocyanin; tissue damage
Foundation item： Shanghai Shrimp Industry Technology System Construction Special Project（HNKGZ〔2014〕7-1-11）
0 引言
【研究意義】凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）因具有生长速度快、抗逆性强，可适应不同盐度、温度及养殖密度环境，以及肉质鲜美、食用率高等特点，在我国沿海地区已广泛养殖，且在内陆省份己成功进行人工养殖（张彬等，2014;邱立国，2017）。在高度集约化养殖模式下，养殖水体极易出现氨氮过量积累，进而对凡纳滨对虾的生长、蜕壳、渗透调节、免疫及排泄等生理活动产生重要影响（孙健，2017;范鹏程等，2019;熊大林等，2020）。氨氮是集约化水产养殖环境中普遍存在的有害因子，因此探究慢性氨氮胁迫对凡纳滨对虾的影响，对促进我国对虾养殖产业高质量发展具有重要意义。【前人研究进展】至今，有关氨氮胁迫对水生动物的影响已有较多研究报道。在生理生化方面，氨氮胁迫会显著影响日本沼虾（Macrobrachium nipponense）血淋巴中的生化指标（王国江，2008），可导致红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）的血细胞总数下降（潘训彬等，2017），对中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）的血淋巴氨氮含量、尿素氮含量及抗氧化能力造成显著影响（王芸等，2017），还会影响拟穴青蟹（Scylla paramamosain）的血清免疫酶活力（彭军辉等，2018）。在生长性能方面，氨氮胁迫对水生动物的摄食、消化及生长均会产生不利影响（崔平和强俊，2018;胡炜等，2018;唐首杰等，2019）。在器官组织病理变化方面，氨氮胁迫通过损伤水生动物的鳃组织及肝胰腺显微结构，致使机体的抗氧化系统和非特异性免疫系统下降，呼吸功能及正常生理代谢受阻，进而引起机体新陈代谢和解毒功能下降（许星鸿等，2014;王贞杰等，2017;陈思涵等，2018）。在基因表达方面，受氨氮胁迫后中国对虾通过调控HSP90基因来保护细胞（王芸等，2013），尼罗罗非鱼通过调控鳃组织、肝脏和肾脏中的不同氨代谢基因共同参与调节氨代谢而提高机体对氨氮的耐受性（吴俊伟等，2016），大弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris）的TNF、IL-1、IL-6和IL-8等炎性反应相关基因表达量持续升高，故推测过度炎性应激可能是导致鱼类氨中毒死亡的主要原因之一（宋美泽等，2018）。【本研究切入点】目前，国内外有关氨氮胁迫凡纳滨对虾的影响研究主要属于急性胁迫，胁迫时间较短，且对虾规格较小，研究结果适用于养殖前期的凡纳滨对虾，而针对中等规格以上凡纳滨对虾长时间处于氨氮胁迫下的毒性试验较少。【拟解决的关键问题】从对虾生长发育、存活率、生理生化指标、鳃组织和肝胰腺显微结构及血蓝蛋白基因相对表达水平等方面综合探究凡纳滨对虾对氨氮胁迫的响应，明确氨氮胁迫对凡纳滨对虾的毒性作用，以期为养殖户在对虾中后期健康养殖管理上提供技术参考，同时丰富凡纳滨对虾的毒理研究资料。
1 材料与方法
1. 1 试验动物
供试凡纳滨对虾取自上海良星水稻种植专业合作社，在盐度2‰且提前曝气2 d的自来水中驯养1周;然后饲养于水泥池中，池水深度1 m。整个试验周期的养殖水体盐度2‰，水温（27.0±1.1）℃，pH 7.60±0.08，气泡石24 h充氧。最初投饵量为初始体重的1.5%，每天投喂3次，并根据摄食情况及时调整投饵量。
1. 2 试验设计
挑选540尾平均初始湿体重9.92±0.24 g/尾的健康凡纳滨对虾，随机分成6组，每组设3个重复，每个重复30尾对虾，分别暴露于不同氨氮浓度（0、4、6、8、12和16 mg/L）的曝气自来水中，胁迫周期20 d。以0 mg/L氨氮浓度为对照。参照孙国铭等（2002）的方法确定氨氮浓度，并根据预试验结果进行适度调整。
1. 3 养殖水体氨氮浓度测定
养殖水体氨氮浓度测定采用纳氏试剂法（王华等，2013），每天测定2次，使用氯化铵调整水体氨氮浓度达稳定状态。根据温度、pH、盐度、总氨氮浓度换算养殖水体分子氨浓度（王琨和韩英，2007）。
1. 4 样品采集及指标测定
分别于胁迫16、17、18、19和20 d时，各胁迫处理组随机选取凡纳滨对虾3尾，采用一次性1.0 mL无菌注射器吸取抗凝剂于凡纳滨对虾头胸甲后缘插入围心窦内抽取血淋巴样品，将抽取的血淋巴样品混匀，用于测定凡纳滨对虾的血淋巴氨氮、尿素氮及血蓝蛋白含量。胁迫16和20 d时随机取样置于冰盘内，剖解取出肝胰脏，去除多余组织，以预冷超纯水洗净，滤纸吸干后置于装有RNA Keeper的1.5 mL离心管中，-80 ℃超低温保存备用。胁迫结束后统计凡纳滨对虾的体长增长率、体重增长率和存活率;同时取鳃组织和肝胰脏制作石蜡切片，用于观察其显微结构的损伤情况。
1. 4. 1 生长指标及存活率计算
体长增长率（%）=（终末体长-初始体长）/初始
体长×100
体重增长率（%）=（终末体重-初始体重）/初始
体重×100
存活率（%）=存活数/初始总数×100
1. 4. 2 血淋巴氨氮尿素氮含量测定 采用南京建成生物工程研究所研发的血氨测定试剂盒和尿素氮测试盒进行血淋巴氨氮和尿素氮含量测定。
1. 4. 3 血蓝蛋白含量测定 采用紫外吸收法测定血蓝蛋白含量，将抽取的血淋巴样品稀释至1%，移液枪吸取0.04 mL血淋巴稀释液，以紫外分光光度计在334 nm波长处测定吸光值，参照王顺昌和许立（2003）的方法换算血蓝蛋白含量。 血蓝蛋白含量（mmol/L）=2.69E[1%1 cm]
式中，E[1%1 cm]表示1%血淋巴稀釋液在光径为1 cm石英比色皿中的吸光值。
1. 4. 4 血蓝蛋白基因表达水平测定 采用UNIQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒（B511321）抽提样品RNA，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测是否存在基因组污染，并使用核酸定量仪检测RNA浓度及纯度。将RNA反转录成cDNA，并根据凡纳滨对虾血蓝蛋白cDNA序列，以Primer Premier 5.0设计实时荧光定量PCR扩增特异性引物（表1），引物合成和cDNA样品测序均委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。完成实时荧光定量PCR检测后，采用2-△△Ct法换算凡纳滨对虾血蓝蛋白基因相对表达量。
1. 4. 5 鳃组织和肝胰腺石蜡切片制作 将鳃组织和肝胰腺放入中性甲醛溶液中固定24 h，以乙醇逐级脱水，石蜡包埋后切片，HE染色，置于生物显微镜（XSP-BM-12CAV）下观察并拍照。
1. 5 统计分析
试验数据采用SPSS 21.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan?s多重比较。
2 结果与分析
2. 1 养殖水体总氨氮与分子氨的浓度变化
上午测定结果（图1-A）显示，对照组（0 mg/L）养殖水体总氨氮浓度维持在0.1～0.6 mg/L，4 mg/L组维持在3.0～5.0 mg/L，6 mg/L组维持在4.7～6.7 mg/L，8 mg/L组维持在6.4～10.2 mg/L，12 mg/L组维持在10.8～14.8 mg/L，16 mg/L组维持在14.3～16.5 mg/L。下午调整养殖水体氨氮浓度后的测定结果（图1-B）显示，对照组（0 mg/L）养殖水体总氨氮浓度维持在0.1～0.3 mg/L，4 mg/L组维持在3.1～4.7 mg/L，6 mg/L组维持在5.3～6.6 mg/L，8 mg/L组维持在7.1～8.8 mg/L，12 mg/L组维持在11.3～13.8 mg/L，16 mg/L组维持在15.1～16.7 mg/L。
上午测定结果（图2-A）显示，对照组（0 mg/L）养殖水体分子氨浓度维持在0.00～0.02 mg/L，4 mg/L组维持在0.07～0.12 mg/L，6 mg/L组维持在0.11～0.16 mg/L，8 mg/L组维持在0.15～0.24 mg/L，12 mg/L组维持在0.25～0.33 mg/L，16 mg/L组维持在0.34～0.39 mg/L。下午调整养殖水体氨氮浓度后的测定结果（图2-B）显示，对照组（0 mg/L）养殖水体分子氨浓度维持在0.00～0.01 mg/L，4 mg/L组维持在0.08～0.11 mg/L，6 mg/L组维持在0.13～0.16 mg/L，8 mg/L组维持在0.17～0.21 mg/L，12 mg/L组维持在0.27～0.31 mg/L，16 mg/L组维持在0.36～0.39 mg/L。
2. 2 凡纳滨对虾的存活率及其生长状况
由表2可知，胁迫15 d后各胁迫处理组凡纳滨对虾存活率随氨氮浓度的增加而逐渐降低，且各胁迫处理组间差异显著（P<0.05，下同）;至胁迫20 d，各胁迫处理组凡纳滨对虾存活率均随胁迫时间的延长继续降低，且显著低于对照组凡纳滨对虾的存活率，随氨氮浓度的增加凡纳滨对虾存活率依次降低。可见，慢性氨氮胁迫下凡纳滨对虾的生存受到显著抑制，且氨氮浓度越高影响越大。由表3可知，胁迫20 d后各胁迫处理组凡纳滨对虾的体重增长率和体长增长率均随氨氮浓度的增加依次降低，且各胁迫处理组间差异显著，说明慢性氨氮胁迫下凡纳滨对虾的生长也受到显著影响。
2. 3 凡纳滨对虾血淋巴氨氮及尿素氮含量的变化
由图3可看出，胁迫15 d后各胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量均明显高于对照组凡纳滨对虾。胁迫16 d时，除4 mg/L组外，其他胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量均显著高于对照组凡纳滨对虾;胁迫17 d时，8、12和16 mg/L组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量显著高于对照组凡纳滨对虾，且以8 mg/L组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量最高;胁迫18 d时也表现为除4 mg/L组外，其他胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量均显著高于对照组凡纳滨对虾，以16 mg/L组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量最高;胁迫19和20 d后，各胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴氨氮含量均显著高于对照组凡纳滨对虾。在血淋巴尿素氮含量方面，各胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量均随氨氮胁迫时间的延长呈先升高后降低的变化趋势，且总体上与水体氨氮浓度呈正相关，高浓度（12和16 mg/L）胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量显著高于对照组凡纳滨对虾（图4）。胁迫18 d时，8、12和16 mg/L组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量显著高于对照组凡纳滨对虾，且各胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量均达最高值，与凡纳滨对虾血淋巴氨氮含量的变化趋势基本吻合;至胁迫20 d时，除4 mg/L组外，其他胁迫处理组凡纳滨对虾的血淋巴尿素氮含量均显著高于对照组凡纳滨对虾。
2. 4 凡纳滨对虾血蓝蛋白含量的变化
由图5可看出，经氨氮胁迫15 d后，各胁迫处理组凡纳滨对虾血蓝蛋白含量均显著低于对照组凡纳滨对虾，且凡纳滨对虾血蓝蛋白含量的变化趋势总体上与水体氨氮浓度呈负相关，表明凡纳滨对虾在长期的氨氮胁迫下其蛋白合成代谢受阻，进而影响血蓝蛋白的合成。血蓝蛋白是含铜的呼吸蛋白，凡纳滨对虾血蓝蛋白含量降低可能会影响其呼吸作用。
2. 5 凡纳滨对虾血蓝蛋白基因表达水平的变化
由图6可知，胁迫15和20 d时各胁迫处理组凡纳滨对虾血蓝蛋白基因的相对表达量均显著低于对照组凡纳滨对虾，且总体上表现为氨氮胁迫时间越长，各胁迫处理组凡纳滨对虾血蓝蛋白基因的相对表达量越低，表明血蓝蛋白基因表达受慢性氨氮胁迫的影响，进而影响血蓝蛋白的合成，以及与血蓝蛋白相关的正常生理功能。 2. 6 凡纳滨对虾鳃组织和肝胰腺显微结构的变化
2. 6. 1 鳃组织的病理变化 由图7可看出，经慢性氨氮胁迫后凡纳滨对虾鳃组织严重受损，鳃呼吸作用及其正常代谢均受到影响，具体病理变化表现为：鳃丝肿胀，核固缩，血淋巴细胞增多，局部空泡化、结构不完整;鳃呼吸上皮细胞大面积脱落，鳃膜碎化，有大量酸性物质分泌，经HE染色呈红色;鳃叶末端的亚几丁质层结构破碎，亚几丁质空间被破坏。
2. 6. 2 肝胰腺的病理变化 由图8可看出，经慢性氨氮胁迫后凡纳滨对虾胰腺管肿大，空泡化严重;星状管腔变形，空泡间的结缔组织被损坏，多个空泡融合为一个大的空泡;肝小管排列紊乱，管腔扩大，边界模糊;肝小管出现破裂，细胞体积增大，细胞大量解体，肝小管间隙和管腔中可观察到破碎的细胞组织。
3 讨论
本研究发现，凡纳滨对虾养殖水体氨氮浓度经每天调整与设计浓度基本一致，偶有升高，其原因可能是剩余饵料及代谢产生的粪便等所引起（吴堃等，2017）。在水体中，氨主要以离子化（NH4+）和非离子化形式（NH3）存在（Dutra et al.，2016），且其浓度变化与水温、盐度及pH均有关（Barbieri，2010;Frisk et al.，2013）。甲壳动物的氨氮排泄也受养殖水体pH影响。于敏等（2007）研究证实，当养殖水体pH≤9.0时，中华绒螯蟹的氨氮排泄变化不明显，但养殖水体pH升高至10.5后，其氨氮排泄急剧下降，且排泄过程具有不连续性。
随着水体NH3含量的升高及胁迫时间的延长，鱼类摄食量开始减少，生长速度减慢，严重者生长开始停滞（唐首杰等，2019）。胡炜等（2018）研究发现，当水体氨氮浓度超过2 mg/L后，刺参的末体重和特定生长率均随氨氮浓度的升高呈显著下降趋势。管敏等（2019）研究表明，在慢性氨氮胁迫下，F2代中华鲟的生长受到显著抑制，其抗氧化能力及免疫能力也同步降低。本研究结果表明，经慢性氨氮胁迫后，凡纳滨对虾的体长增长率、增重增长率和存活率均随氨氮浓度的升高而呈递减趋势，说明氨氮胁迫浓度升高对凡纳缤对虾的生长及生存有明显影响。此外，随着胁迫时间的延长，各胁迫处理组凡纳滨对虾血淋巴氨氮不断积累，至胁迫19和20 d时其含量均显著高于对照组凡纳滨对虾，与王芸等（2017）的研究结果相似，即随着氨氮胁迫时间的延长，中国明对虾血淋巴氨氮含量逐渐积累。甲壳类动物的尿素氮生成主要来源于鸟苷酸循环及尿酸分解，而后者的形成主要源于核苷酸降解。本研究结果表明，慢性氨氮胁迫下凡纳滨对虾血淋巴中的尿素氮和氨氮含量变化趋势基本一致，可能是随着凡纳滨对虾血淋巴氨氮含量的升高，凡纳滨对虾会启动自身的解毒机制，将毒性较强的氨氮转化为相对较弱的尿素氮（于敏等，2008）。
血蓝蛋白是位于节肢动物（螯肢类、甲壳类、多足类和蜘蛛类）和软体动物（腹足类和头足类）血淋巴中的含铜呼吸蛋白，除了具有输氧功能外，还可通过多种方式参与机体免疫防御，是虾蟹等水产养殖动物重要的多功能免疫因子（张泽蕙等，2016;窦全伟，2018）。王国江（2008）研究表明，氨氮和亚硝态氮对日本沼虾血淋巴中的血细胞数量、生理生化指标、酚氧化酶活性及血蓝蛋白含量均产生显著影响。本研究发现，慢性氨氮胁迫15 d后，各胁迫处理组凡纳滨对虾血蓝蛋白含量均显著低于对照组凡纳滨对虾，且凡纳滨对虾血蓝蛋白含量的变化趋势总体上与水体氨氮浓度呈负相关，血蓝蛋白基因的表达水平与血蓝蛋白含量变化趋势基本相符，总体上表现为氨氮胁迫时间越长，凡纳滨对虾血蓝蛋白基因的相对表达量越低。可见，慢性氨氮胁迫通过下调凡纳滨对虾血蓝蛋白基因表达，而阻碍血蓝蛋白合成，进而影响凡纳滨对虾的呼吸功能及免疫功能等，可能是导致其死亡的主要原因。
氨氮是当前水产养殖环境中普遍存在的污染因子，可通过水生动物的鳃组织而渗入其血淋巴中，从而引起血淋巴氨氮含量升高，同时对鳃组织结构造成损伤。鳃组织与外界水环境直接接觸，当水环境中存在不利因子如重金属时，极易对鳃组织造成损伤（王权等，2012）。已有研究表明，长期氨氮胁迫对凡纳滨对虾的鳃组织和肝胰腺均会造成严重损伤（赵卫红等，2014;Liu et al.，2014）。此外，水环境变化会影响甲壳类动物肝胰腺中B细胞和R细胞的组成比例（赵柳兰，2012;韩晓琳等，2014）。本研究结果表明，经慢性氨氮胁迫后凡纳滨对虾鳃组织严重受损，鳃丝肿胀，核固缩，血淋巴细胞增多，局部空泡化、结构不完整，鳃呼吸上皮细胞大面积脱落，有大量酸性物质分泌，鳃叶末端的亚几丁质层结构破碎，亚几丁质空间被破坏;胰腺管肿大，空泡化严重，肝小管排列紊乱，管腔扩大，边界模糊，肝小管间隙和管腔中可观察到破碎的细胞组织。可见，慢性氨氮胁迫引起的呼吸功能障碍及肝胰腺代谢功能紊乱，是导致凡纳滨对虾应激死亡的主要原因。
4 结论
慢性氨氮胁迫对凡纳滨对虾的生长及生存有明显影响，造成血淋巴氨氮和尿素氮含量增加，并下调血蓝蛋白基因表达及阻碍血蓝蛋白合成，凡纳滨对虾的鳃组织和肝胰腺严重受损。即慢性氨氮胁迫引起的呼吸功能障碍及肝胰腺代谢功能紊乱，是导致凡纳滨对虾应激死亡的主要原因。
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（责任编辑 兰宗宝）