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摘要 [目的]采用二极管阵列高效液相色谱法，建立饲料中莫昔克丁的检测方法。[方法]样品经乙腈溶液提取后，通过HLB 6cc SPE固相萃取小柱净化，C18色谱柱分离;以醋酸-醋酸铵缓冲液（pH 4.8）（取醋酸铵7.7 g，加水400 mL溶解后，用冰醋酸调节pH至4.8）-乙腈（400∶600）为流动相;检测波长为242 nm;柱温50 ℃;流速为2.5 mL/min。[结果]莫昔克丁在5～100 μg/mL具有良好的线性关系（R.2=0.999 0）。检出限为0.5 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg。样品在定量限1倍、2倍、10倍3个加标水平下的平均回收率为95.0%～105.2%，批内、批间的相对标准偏差小于10%，日间和日内变异系数均低于15%。[结论]该试验建立的HPLC法简便、灵敏、准确，可用于饲料中莫昔克丁的含量测定。
关键词 饲料;莫昔克丁;含量测定;HPLC法
中图分类号 S816.17 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）07-0197-02
Abstract [Objective]A method for the determination of moxidectin feed by diode array high performance liquid chromatography （DADHPLC）was established.[Method]The sample was extracted by acetonitrile solution and purified by HLB 6cc SPE SPE solid phase extraction column. The mobile phase was acetic acidammonium acetate buffer （pH 4.8） （7.7 g ammonium acetate was dissolved in 400 mL water， and pH was adjusted to 4.8 with glacial acetic acid） acetonitrile （400∶600） as the mobile phase;the detection wavelength was 242 nm;the column temperature was 50 ℃;the flow rate was 2.5 mL/min. [Result]There was a good linear relationship in the range of 5-100 μg/mL （R.2=0.999 0）. The detection limit was 0.5 mg/kg and the limit of quantitation was 1.0 mg/kg. The average recoveries of the samples were 950% - 105.2% at 1， 2 and 10 times of the limit of quantification （LOQ）. The intra and inter assay relative deviations were less than 10%， and the interday and intraday coefficients of variation were less than 15%. [Conclusion]The HPLC method established in this experiment is simple， sensitive and accurate， and can be used to determine the content of moxidectin in feed.
Key words Feed;Moxidectin;Content determination;HPLC method
作者簡介 刘红云（1975—），女，安徽合肥人，高级兽医师，硕士，从事兽药、饲料、畜牧产品检测和研究工作。
莫昔克丁是一种新型抗寄生虫药，是由链霉菌发酵产生、成分单一、半合成的大环内酯类药物。莫昔克丁比阿维菌素类药物具有更好的驱虫活性，同时具有长效、安全等特性，且极低剂量下就有很强的抗线虫和节肢动物等体内外寄生虫活性，对猪体内的消化道线虫、肺线虫和体外寄生虫都有良好的驱杀效果[1-5]。20世纪80年代中期，莫昔克丁开始作为兽用驱虫药使用。作为新一代驱虫药物，莫昔克丁能够高效地杀灭线虫和体表寄生虫，同时对动物有很好的安全性。现有的杀虫剂伊维菌素、阿维菌素等异味较大，施用后无论是对于动物还是使用者而言都有较为严重的感官刺激。有效防治寄生虫病，定期驱虫、杀虫是养殖环节的重要工作。但是随着民众对食品安全的重视，需要合理规范用药[6-7]。目前文献报道中尚无饲料中莫昔克丁的含量测定。该试验参照相关文献，采用乙腈提取，通过HLB 6cc SPE固相萃取小柱净化，C18色谱柱分离，旨在建立灵敏度高的、快速高效的二极管阵列高效液相色谱法，制定莫昔克丁在饲料中的检测方法[8-10]，以期为饲料安全保驾护航。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
U3000戴安高效液相色谱仪，配安二极管阵列检测器，美国热电公司;BT-125D 电子天平，赛多利斯;KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;立式低温高速离心机CF16RN，日立公司;IKA涡旋混合机，上海沪西分析仪器厂有限公司;HGG-12A氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司;HEI-VAP型旋转蒸发器，德国海道夫;HLB 6cc SPE固相萃取柱（500 mg/6 mL填料）;0.22 μm微孔滤膜，天津津腾试验设备有限公司。 1.2 药品与试剂
莫昔克丁标准品Dr 113507-06-5，德国;乙醇、甲醇、醋酸、醋酸铵，均为分析纯，国药集团;乙腈、甲醇为色谱纯，美国Biopure;试验用水为 milli-Q 超纯水。洗脱液为95%乙醇-甲醇（95∶5）。
莫昔克丁标准储备溶液的制备：精密称取莫昔克丁标准品100 mg，置于50 mL容量瓶中，加乙腈溶解定容，该溶液中莫昔克丁浓度为2 mg/mL，于冰箱4 ℃保存，可使用1个月。
1.3 样品处理
1.3.1 提取。取5.0 g（预混合饲料2.0 g）样品，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL乙腈均质提取1 min，80 000 r/min离心10 min，备用。
1.3.2 净化。精密量取5 mL上清液，直接过HLB 6cc SPE固相萃取柱，收集全部流出液，加10 mL洗脱液，收集流出液与洗脱液于茄形瓶中，用旋转蒸发器在60～70 ℃蒸干，精密加入2 mL乙腈定容，过0.22 μm微孔滤膜上机检测。
1.4 色谱条件
色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为醋酸-醋酸铵缓冲液（pH 4.8）（取醋酸铵7.7 g，加水400 mL溶解后，用冰醋酸调节pH至4.8）-乙腈（400∶600），检测波长为242 nm;柱溫50 ℃;流速为2.5 mL/min。色谱和光谱图见图1～3。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
分别精密量取“1.2”标准储备溶液适量，加乙腈稀释成浓度约为5、10、20、50、100 μg/mL的系列溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以标准溶液的浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程为Y=0.469 2X+0.084（R.2=0.999 0），表明莫昔克丁浓度在5～100 μg/mL与峰面积呈现良好的线性关系。
2.2 检出限和定量限
添加适量标准储备溶液于空白饲料中，经提取后测定，以信噪比（S/N）为3作为方法的检出限（LOD），以信噪比（S/N）为10作为方法的定量限（LQD），得出莫昔克丁的检出限为0.5 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg。
2.3 回收率和精密度测定
在空白饲料样品中添加莫昔克丁定量限的1倍（1.0 mg/kg）、2倍（2.0 mg/kg）、10倍（10.0 mg/kg）3个水平的标准溶液进行加标回收试验，每个添加水平的浓度做5个平行样品，连续测定3次，求其平均回收率、相对标准偏差（RSD）。 结果显示（表1），莫昔克丁在3个加标水平的平均回收率为95.0%～105.5%，批内批间相对标准偏差小于10%。
3 讨论
3.1 样品提取及净化方法的优化
莫昔克丁不溶于水，易溶于甲醇、乙腈、乙醇等溶剂。饲料成分复杂，尤其是预混料，粉尘颗粒较多，若净化效果不好将严重影响结果的判定，而且饲料样品基质复杂，因此对样品基质效应进行了考察。制备了3个样品，分别为标准品溶液、空白样品基质提取后添加标准溶液、空白样品基质提取前添加标准溶液，按“1.3”方法制成上机样品。试验结果显示，无明显基质效应。
饲料基质复杂，不同的提取溶剂对回收率的影响较大。该研究考察了甲醇、乙腈、乙醇作为提取剂对莫昔克丁回收率的影响，乙腈是一种中等极性的提取溶剂，与大多数兽药的极性较接近，试验结果显示，乙腈的提取效率最好，对不同浓度的添加试验其回收率均高于80%，符合饲料中药物检测的要求。在对均质时间、离心的转速和时间的选择上，通过试验最终确定均质1 min、8 000 r/min离心10 min的除杂效果最好。
该试验用固相萃取技术进行样品净化。考察了MCX、PCX、WCX、HLB 4种固相萃取柱对目标物回收率和稳定性的影响，发现HLB柱好于MCX、PCX、WCX，HLB固相萃取小柱有别于传统的固相萃取小柱，它净化时也不需要不同极性或pH的溶剂进行淋洗、洗脱等，该小柱能极大地提高样品分析通道。试验最终选用HLB固相萃取柱。在洗脱液的选择上，分别考察了95%乙醇-甲醇95∶5、80∶20、60∶40、40∶60、20∶80这5种体积比例的洗脱液，试验结果显示95%乙醇-甲醇体积比例为95∶5时，目标物的回收率最高，最后确定洗脱液为95%乙醇-甲醇（95∶5）。
3.2 色谱条件的优化
莫昔克丁在反相色谱柱上能较好的保留，采用C18色谱柱分离，莫昔克丁峰形良好，受基质干扰少。试验选择了4款不同品牌的反相色谱柱Phenomenex Luna C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）、Waters XSelect CSH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Aglient Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和依特利SinoChromODS-AP8（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行样品分析，结果表明4种品牌色谱柱均可使莫昔克丁分离度、理论塔板数、对称因子良好。
4 结论
该研究采用乙腈溶液提取，通过HLB 6cc SPE固相萃取小柱净化，C18色谱柱分离，建立了二极管阵列HPLC法测定饲料中莫昔克丁的方法。结果显示，莫昔克丁5～100 μg/mL具有良好的线性关系（R.2=0.999 0）。检出限为0.5 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg。样品在定量限1倍、2倍、10倍3个加标水平下的平均回收率为95.0%～105.2%，批内、批间的相对标准偏差小于10%，日间和日内变异系数均低于15%。该试验建立的HPLC法灵敏度高、专属性强，满足复杂饲料中莫昔克丁含量的测定。
参考文献
[1] 何勇崴，岳光.利用液液萃取降低莫昔克汀杂质含量的研究[J].国外医药（抗生素分册），2020，41（1）：76-80.
[2] 刘开永，李英伦，周岷江，等.新一代驱虫抗生素——莫西菌素[J].动物医学进展，2003，24（4）：59-62.
[3] 李林霞，崔耀文，沈建忠，等.猪肉中莫昔克汀残留高效液相色谱-荧光检测方法的建立[J].中国农业大学学报，2011，16（1）：84-87.
[4] 李娇，李庆山，徐凤波.莫西菌素在畜牧业中的应用研究进展[J].中国畜牧兽医，2018，45（12）：3587-3593.
[5] 杨晓野，SATRI F.利用Moxidectin对放牧初期牛毛圆科线虫感染的控制[J].内蒙古农牧学院学报，1995（3）：68-72.
[6] 谢等龙，陈国庆，王以跃，等.莫昔克汀浇泼剂的制备及其稳定性研究[J].中兽医医药杂志，2016，35（2）：43-44.
[7] MARKOVICS A，王明萱.新驱虫药玛西的汀（MOXIDECTIN）对绵羊胃肠道和肺线虫的药效[J].中国兽医寄生虫病，1998，6（2）：53-54.
[8] 潘新明，潘守奇，于金玲，等.液相色谱串联质谱检测动物源性食品中莫西丁克残留[J].安徽农业科学，2011，39（22）：13563-13564，13567.
[9] 刘苗，胡春.莫西菌素（Moxidectin）[J].中国药物化学杂志，2019，29（1）：81.
[10] 李秉鸿.莫西菌素抗两种线虫效力持久性试验[J].畜牧兽医科技信息，1998（23）：9.
关键词 饲料;莫昔克丁;含量测定;HPLC法
中图分类号 S816.17 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）07-0197-02
Abstract [Objective]A method for the determination of moxidectin feed by diode array high performance liquid chromatography （DADHPLC）was established.[Method]The sample was extracted by acetonitrile solution and purified by HLB 6cc SPE SPE solid phase extraction column. The mobile phase was acetic acidammonium acetate buffer （pH 4.8） （7.7 g ammonium acetate was dissolved in 400 mL water， and pH was adjusted to 4.8 with glacial acetic acid） acetonitrile （400∶600） as the mobile phase;the detection wavelength was 242 nm;the column temperature was 50 ℃;the flow rate was 2.5 mL/min. [Result]There was a good linear relationship in the range of 5-100 μg/mL （R.2=0.999 0）. The detection limit was 0.5 mg/kg and the limit of quantitation was 1.0 mg/kg. The average recoveries of the samples were 950% - 105.2% at 1， 2 and 10 times of the limit of quantification （LOQ）. The intra and inter assay relative deviations were less than 10%， and the interday and intraday coefficients of variation were less than 15%. [Conclusion]The HPLC method established in this experiment is simple， sensitive and accurate， and can be used to determine the content of moxidectin in feed.
Key words Feed;Moxidectin;Content determination;HPLC method
作者簡介 刘红云（1975—），女，安徽合肥人，高级兽医师，硕士，从事兽药、饲料、畜牧产品检测和研究工作。
莫昔克丁是一种新型抗寄生虫药，是由链霉菌发酵产生、成分单一、半合成的大环内酯类药物。莫昔克丁比阿维菌素类药物具有更好的驱虫活性，同时具有长效、安全等特性，且极低剂量下就有很强的抗线虫和节肢动物等体内外寄生虫活性，对猪体内的消化道线虫、肺线虫和体外寄生虫都有良好的驱杀效果[1-5]。20世纪80年代中期，莫昔克丁开始作为兽用驱虫药使用。作为新一代驱虫药物，莫昔克丁能够高效地杀灭线虫和体表寄生虫，同时对动物有很好的安全性。现有的杀虫剂伊维菌素、阿维菌素等异味较大，施用后无论是对于动物还是使用者而言都有较为严重的感官刺激。有效防治寄生虫病，定期驱虫、杀虫是养殖环节的重要工作。但是随着民众对食品安全的重视，需要合理规范用药[6-7]。目前文献报道中尚无饲料中莫昔克丁的含量测定。该试验参照相关文献，采用乙腈提取，通过HLB 6cc SPE固相萃取小柱净化，C18色谱柱分离，旨在建立灵敏度高的、快速高效的二极管阵列高效液相色谱法，制定莫昔克丁在饲料中的检测方法[8-10]，以期为饲料安全保驾护航。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
U3000戴安高效液相色谱仪，配安二极管阵列检测器，美国热电公司;BT-125D 电子天平，赛多利斯;KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;立式低温高速离心机CF16RN，日立公司;IKA涡旋混合机，上海沪西分析仪器厂有限公司;HGG-12A氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司;HEI-VAP型旋转蒸发器，德国海道夫;HLB 6cc SPE固相萃取柱（500 mg/6 mL填料）;0.22 μm微孔滤膜，天津津腾试验设备有限公司。 1.2 药品与试剂
莫昔克丁标准品Dr 113507-06-5，德国;乙醇、甲醇、醋酸、醋酸铵，均为分析纯，国药集团;乙腈、甲醇为色谱纯，美国Biopure;试验用水为 milli-Q 超纯水。洗脱液为95%乙醇-甲醇（95∶5）。
莫昔克丁标准储备溶液的制备：精密称取莫昔克丁标准品100 mg，置于50 mL容量瓶中，加乙腈溶解定容，该溶液中莫昔克丁浓度为2 mg/mL，于冰箱4 ℃保存，可使用1个月。
1.3 样品处理
1.3.1 提取。取5.0 g（预混合饲料2.0 g）样品，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL乙腈均质提取1 min，80 000 r/min离心10 min，备用。
1.3.2 净化。精密量取5 mL上清液，直接过HLB 6cc SPE固相萃取柱，收集全部流出液，加10 mL洗脱液，收集流出液与洗脱液于茄形瓶中，用旋转蒸发器在60～70 ℃蒸干，精密加入2 mL乙腈定容，过0.22 μm微孔滤膜上机检测。
1.4 色谱条件
色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为醋酸-醋酸铵缓冲液（pH 4.8）（取醋酸铵7.7 g，加水400 mL溶解后，用冰醋酸调节pH至4.8）-乙腈（400∶600），检测波长为242 nm;柱溫50 ℃;流速为2.5 mL/min。色谱和光谱图见图1～3。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
分别精密量取“1.2”标准储备溶液适量，加乙腈稀释成浓度约为5、10、20、50、100 μg/mL的系列溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以标准溶液的浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程为Y=0.469 2X+0.084（R.2=0.999 0），表明莫昔克丁浓度在5～100 μg/mL与峰面积呈现良好的线性关系。
2.2 检出限和定量限
添加适量标准储备溶液于空白饲料中，经提取后测定，以信噪比（S/N）为3作为方法的检出限（LOD），以信噪比（S/N）为10作为方法的定量限（LQD），得出莫昔克丁的检出限为0.5 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg。
2.3 回收率和精密度测定
在空白饲料样品中添加莫昔克丁定量限的1倍（1.0 mg/kg）、2倍（2.0 mg/kg）、10倍（10.0 mg/kg）3个水平的标准溶液进行加标回收试验，每个添加水平的浓度做5个平行样品，连续测定3次，求其平均回收率、相对标准偏差（RSD）。 结果显示（表1），莫昔克丁在3个加标水平的平均回收率为95.0%～105.5%，批内批间相对标准偏差小于10%。
3 讨论
3.1 样品提取及净化方法的优化
莫昔克丁不溶于水，易溶于甲醇、乙腈、乙醇等溶剂。饲料成分复杂，尤其是预混料，粉尘颗粒较多，若净化效果不好将严重影响结果的判定，而且饲料样品基质复杂，因此对样品基质效应进行了考察。制备了3个样品，分别为标准品溶液、空白样品基质提取后添加标准溶液、空白样品基质提取前添加标准溶液，按“1.3”方法制成上机样品。试验结果显示，无明显基质效应。
饲料基质复杂，不同的提取溶剂对回收率的影响较大。该研究考察了甲醇、乙腈、乙醇作为提取剂对莫昔克丁回收率的影响，乙腈是一种中等极性的提取溶剂，与大多数兽药的极性较接近，试验结果显示，乙腈的提取效率最好，对不同浓度的添加试验其回收率均高于80%，符合饲料中药物检测的要求。在对均质时间、离心的转速和时间的选择上，通过试验最终确定均质1 min、8 000 r/min离心10 min的除杂效果最好。
该试验用固相萃取技术进行样品净化。考察了MCX、PCX、WCX、HLB 4种固相萃取柱对目标物回收率和稳定性的影响，发现HLB柱好于MCX、PCX、WCX，HLB固相萃取小柱有别于传统的固相萃取小柱，它净化时也不需要不同极性或pH的溶剂进行淋洗、洗脱等，该小柱能极大地提高样品分析通道。试验最终选用HLB固相萃取柱。在洗脱液的选择上，分别考察了95%乙醇-甲醇95∶5、80∶20、60∶40、40∶60、20∶80这5种体积比例的洗脱液，试验结果显示95%乙醇-甲醇体积比例为95∶5时，目标物的回收率最高，最后确定洗脱液为95%乙醇-甲醇（95∶5）。
3.2 色谱条件的优化
莫昔克丁在反相色谱柱上能较好的保留，采用C18色谱柱分离，莫昔克丁峰形良好，受基质干扰少。试验选择了4款不同品牌的反相色谱柱Phenomenex Luna C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）、Waters XSelect CSH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Aglient Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和依特利SinoChromODS-AP8（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行样品分析，结果表明4种品牌色谱柱均可使莫昔克丁分离度、理论塔板数、对称因子良好。
4 结论
该研究采用乙腈溶液提取，通过HLB 6cc SPE固相萃取小柱净化，C18色谱柱分离，建立了二极管阵列HPLC法测定饲料中莫昔克丁的方法。结果显示，莫昔克丁5～100 μg/mL具有良好的线性关系（R.2=0.999 0）。检出限为0.5 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg。样品在定量限1倍、2倍、10倍3个加标水平下的平均回收率为95.0%～105.2%，批内、批间的相对标准偏差小于10%，日间和日内变异系数均低于15%。该试验建立的HPLC法灵敏度高、专属性强，满足复杂饲料中莫昔克丁含量的测定。
参考文献
[1] 何勇崴，岳光.利用液液萃取降低莫昔克汀杂质含量的研究[J].国外医药（抗生素分册），2020，41（1）：76-80.
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[3] 李林霞，崔耀文，沈建忠，等.猪肉中莫昔克汀残留高效液相色谱-荧光检测方法的建立[J].中国农业大学学报，2011，16（1）：84-87.
[4] 李娇，李庆山，徐凤波.莫西菌素在畜牧业中的应用研究进展[J].中国畜牧兽医，2018，45（12）：3587-3593.
[5] 杨晓野，SATRI F.利用Moxidectin对放牧初期牛毛圆科线虫感染的控制[J].内蒙古农牧学院学报，1995（3）：68-72.
[6] 谢等龙，陈国庆，王以跃，等.莫昔克汀浇泼剂的制备及其稳定性研究[J].中兽医医药杂志，2016，35（2）：43-44.
[7] MARKOVICS A，王明萱.新驱虫药玛西的汀（MOXIDECTIN）对绵羊胃肠道和肺线虫的药效[J].中国兽医寄生虫病，1998，6（2）：53-54.
[8] 潘新明，潘守奇，于金玲，等.液相色谱串联质谱检测动物源性食品中莫西丁克残留[J].安徽农业科学，2011，39（22）：13563-13564，13567.
[9] 刘苗，胡春.莫西菌素（Moxidectin）[J].中国药物化学杂志，2019，29（1）：81.
[10] 李秉鸿.莫西菌素抗两种线虫效力持久性试验[J].畜牧兽医科技信息，1998（23）：9.