【摘 要】
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目的:克隆出人T-钙粘蛋白基因,并应用pEGFP-N1构建其重组真核表达载体。方法:Trizol液氮研磨法提取出人子宫平滑肌组织总RNA。设计一对分别含有EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点的人T-
【机 构】
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承德医学院附属医院皮肤科,承德医学院附属医院中心实验室,
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目的:克隆出人T-钙粘蛋白基因,并应用pEGFP-N1构建其重组真核表达载体。方法:Trizol液氮研磨法提取出人子宫平滑肌组织总RNA。设计一对分别含有EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点的人T-钙粘蛋白基因上下游引物。利用Pfx DNA聚合酶高保真RT-PCR扩增cDNA,并将其连接到pEGFP-N1的多克隆位点,然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果:提取的人子宫平滑肌组织总RNA可清楚看到28S、18S和5S rRNA带形。反转录出的cDNA为2.142kb,将其与pEGFP-N1均进行EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,之后用T4连接酶将二者进行连接,产物电泳可见在7 500bp附近有一条带,即为pEGFP-N1/T-cadherin,双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确。结论:重组真核表达载体pEGFP-N1/T-cadherin构建成功,为下一步研究人T-钙粘蛋白基因在黑色素瘤中的作用奠定基础。
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