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摘要 条纹病是重要的种传真菌病害之一，能对大麦生产造成严重产量损失。本研究利用AFLP方法对来自青海、河南等10省份大麦种植区的条纹病菌菌株进行遗传多样性分析，从分子水平上揭示我国不同大麦产区的条纹病菌群体遗传差异。结果显示，利用8对AFLP选择性引物组合对19份大麦条纹病菌进行了全基因组多态性扩增，共获得144条可统计的条带，其中112条具有多态性，多态性条带占77.8%。在相似系数为0.83时，可将19份大麦条纹病菌菌株划分为4个类群，多数菌株聚类在类群Ⅰ和类群Ⅱ中，类群Ⅲ和类群Ⅳ中仅各包含1个菌株，且与其他2个类群中的成员亲缘关系较远。因此，我国大麦条纹病菌群体中存在一定程度的遗传变异。另外，发现菌株间亲缘关系远近与其分布地域无明显规律。
关键词 大麦； 条纹病； 麦类核腔菌； AFLP标记； 聚类分析
中图分类号： S 435.123
文献标识码： A
大麦条纹病是通过种子传播的系统性侵染真菌病害，病原菌无性阶段为禾内脐蠕孢[Drechslera graminea（Rabenh. ex Schl.）Shoemaker，异名Helminthosporium gramineum Rabenh.]，有性阶段为麦类核腔菌[Pyrenophora graminea （Rabenk.） Ito et Kurib.]。该病害在世界各大麦种植区域均有分布，曾在我国长江流域地区如江苏、上海、浙江和四川等省（市）危害较重，发病严重地块病株率可达30%～40%[1]。近年来，采用新型的种子处理杀菌剂能有效地防治大麦条纹病，但种子药剂处理技术在甘肃、云南、西藏和青海等部分大麦、青稞种植区域还未得到普及或不能有效应用，这些地区的条纹病还很严重。
麦类核腔菌群体在生物学形态特征、毒性和DNA多态性等方面存在差异，并存在毒性变异和生理分化现象，不同菌株间毒性差异较大。在叙利亚和阿尔及利亚的调查中发现，不同毒性菌株的分布具有明显的地域特征[23]。Arabi等通过有性杂交研究了条纹病菌毒性变异的遗传特征，认为其毒性由1个显性基因控制[4]。郑果利用随机扩增多态性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分子标记技术分析了来自甘肃省不同地区的11个菌株的遗传多样性，发现菌株间遗传距离与大麦品种类型、分布区域以及毒性强弱有相关性[2]。吴宽然对来自我国11个省份579个条纹病菌菌株基因组ITS进行扩增测序，共检测到13个SNP变异位点和15种变异类型，同时发现菌株之间的毒性差异较大，即使来源于同一地区同一品种的同一变异类型的菌株，其毒性也不相同[5]。Arabi等在利用ITSRFLP技术对来源于叙利亚不同地区的56个菌株的DNA多态性分析中发现，叙利亚P.graminea群体具有较高的遗传多样性[6]，此外还比较了IRAP（interretrotransposon amplified polymorphism）和ITSRFLP分析大麦条纹病菌的遗传多样性的效率[7]。
本研究利用AFLP 技术，对19个来自我国不同大麦种植地区的大麦条纹病菌进行分析，明确我国各大麦、青稞产区条纹病菌在DNA水平的遗传变异及地区间相互交流情况，进而为研究病原菌的毒性变异和有效防控提供参考信息。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
2012-2014年，从我国各大麦及青稞种植地区采集大麦条纹病典型病株标样，利用组织分离法[10]从典型病叶组织中分离病原菌，将灭菌的滤纸片（4.5 mm × 4.5 mm）与病原菌在PDA平板上共培养，直到菌落长满培养皿，收集滤纸片于灭菌2次的硫酸纸袋中，室温条件下脱水干燥2～3 d后长期保存于-20℃冰箱中。将表面消毒后的感病叶片组织保湿培养，待病组织上产生分生孢子后利用显微镜进行形态学鉴定，同时挑取单个分生孢子，获得其纯培养物。本研究中所用的菌株均经rDNAITS扩增并测序，与NCBI数据库中P.graminea的rDNAITS序列进行比对验证，确认分离病原菌确为P.graminea。供试大麦条纹病菌菌株信息列于表1。
1.2 DNA提取
将供试菌株接种在直径9 cm 的PDA平板上，在室温条件下培养，每天定时打开培养架日光灯管，补充散射光4 h，每个菌株培养2皿，在菌落长满平板后打开培养皿盖，覆盖双层纱布后室温条件下干燥2～4 d，从培养基平板上刮取并收集菌丝，置于1个2 mL EP管中液氮中保存备用。采用CTAB法提取P.graminea基因组DNA。每个样品在液氮中充分研磨后加入0.65 mL 改良的DNA提取液[0.01 mol/L pH 8.0 TrisHCl 缓冲液中含2% （W/V） CTAB，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2%（V/V）巯基乙醇]。通过0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测，DNA样品无降解且带型整齐，杂质很少。经紫外分光光度法检测A260 nm/A280 nm比值为1.8～2.0，DNA样品纯度较高。
1.3 PCR模板制备
利用分光光度计NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）测定样品DNA的浓度，并稀释到500.0 ng/μL，-20℃保存备用。利用PstⅠ和MseⅠ限制性内切酶对供试菌株的基因组DNA样品进行双酶切，37℃水浴3 h。反应体系为20 μL，包括基因组DNA 500 ng，Pst Ⅰ酶（10 U/μL）0.5 μL，Mse Ⅰ酶（10 U/μL）0.5 μL，10×Tango缓冲液2.0 μL，补加ddH2O至20 μL。酶切产物直接进行连接反应。连接接头的反应体系包括：酶切产物5. 0 μL，PstⅠ接头（5 pmol/μL）1.0 μL，MseⅠ接头（50 pmol/μL）1.0 μL，10×连接缓冲液2.0 μL，T4DNA 连接酶（5 U/μL）0.5 μL，补加ddH2O至20 μL。37℃连接反应3 h，连接完成后，取5 μL连接产物在1.0%琼脂糖凝胶上检测酶切连接结果，酶切连接产物片段电泳后从上至下呈均匀的“弥散”状分布，说明DNA样品酶切彻底；取1.0 μL酶切连接产物作为PCR模板，利用一对预扩增引物进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后从上至下也呈均匀的“弥散”状，说明制备的菌株基因组DNA模板符合AFLP分析后续试验的要求。PCR扩增接头（表2）由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。双链DNA接头合成：将10.0 μmol/L PstⅠ单链接头，100 μmol/L MseⅠ单链接头等体积混合后95℃变性5 min，37℃复性10 min，分别合成浓度为5 pmol/μL和50 pmol/μL双链接头，贮存在-20℃。 1.4 PCR扩增
选用1对预扩增引物和32对选择性扩增引物， 以大麦条纹病菌基因组DNA样品酶切连接产物为PCR模板，进行AFLP片段多态性扩增（表3），所用引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
预扩增PCR反应体系为20 μL，包括：连接产物 2.0 μL，PstⅠG（5 pmol/μL）1.0 μL，MseⅠC（5 pmol/μL）1.0 μL，10×Easy Taq缓冲液2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.6 μL，Easy Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，加ddH2O至20 μL。预扩增PCR反应程序：94℃ 3 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃10 min，4℃ 30 min。反应结束后取5 μL预扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上检测结果，部分预扩增产物稀释50倍用于下一步选择性扩增，剩余预扩增产物置于-20℃冰箱中保存备用。
选择性扩增PCR反应体系为20 μL，包括：DNA模板（即预扩增PCR产物）5.0 μL，PstⅠ选择性引物（5 pmol/μL）2.0 μL，MseⅠ选择性引物（5 pmol/μL）2.0 μL，10×Easy Taq缓冲液2.0 μL，dNTPs （2.5 mmol/L 0.8 μL，Easy Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，加ddH2O至20 μL。选择性扩增PCR反应程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，12个循环，每个循环退火温度降低0.7℃；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 1 min，23个循环；72℃ 10 min，4℃ 30 min。
1.5 PCR产物电泳检测
选择性PCR产物样品3 μL经浓度为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测，电泳恒定功率P=85 W，I=200 mA，预电泳30 min，使得玻璃板的温度达到50℃左右，加样品后电泳约1 h。银染显色后，将凝胶平板放在室内晾干，然后扫描图片保存，统计清晰的电泳条带。
1.6 数据统计分析
采用二进位制记录，在扩增的相同位点处依据条带的有无分别记做1和0，并将统计结果用统计分析软件NTSYSpc 2.2计算材料间的遗传距离，再用非加权配对算术平均法（UPGMA）对遗传相似系数进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 大麦条纹病菌分离与纯化
大麦条纹病菌不同菌株在PDA平板上菌落生长速度、颜色和形态略有不同，如图1所示19个菌株中菌落形态特征具有代表性的6个菌株。培养2周后，菌落直径范围2.6～5.4 cm，多数菌落为圆形，菌落正面为白色、浅黄色或浅灰色，有的菌落边缘呈橘红色，中央略隆起，絮状，菌丝发达，但疏密程度略有差异；背面对应隆起部位呈青褐色、灰黑色或浅橘红色，其边缘部位呈浅黄色或粉红色。其他13个菌株的菌落在PDA平板上正面呈白色或浅灰色，背面呈褐色或灰黑色，菌落边缘呈白色或浅黄色。菌落生长速率、菌丝疏密程度等性状与图1中所示菌株类似。随着培养时间延长，菌落颜色也会变化，一般会加深变暗，呈灰黑色或深褐色。
2.2 PCR扩增结果
本实验室前期预备试验中比较了不同预扩增引物扩增效果，选择其中1对AFLP预扩增引物（PstⅠG MseⅠC），并从32对AFLP选择性扩增引物中筛选出8对引物，对供试的大麦条纹病菌的全基因组DNA进行片段长度多态性扩增，获得了较好的扩增结果（图2）。共扩增出144条谱带，片段大小67～501 bp，其中112条具有多态性，占总数77.8%，平均每对引物组合能扩增出18条可统计的条带，其中14条条带具有多态性（表4）。
2.3 多态性聚类分析
对供试的19份大麦条纹病菌菌株的AFLP遗传多态性聚类分析表明，菌株间相似系数分布在0.60～0.99之间（图3）。可以看出，以相似系数0.83为标准，将19份大麦条纹病菌可分4个类群（P.graminea groups，PGs）：PGⅠ中7个菌株分为两个亚类，第一亚类包括6个菌种，即BS14029、BS13006、BS12072、BS11086、BS11087和BS12073，分别从来自浙江、云南、青海、西藏采集的条纹病标本上分离获得；第二亚类包括1个菌种即BS12064，是自2012年河北廊坊试验地采集的标本中分离得到的菌株。PGⅡ包括10个菌株，聚类成2个亚类：第一亚类包括5个菌株，即BS13031、BS13057、BS14094、BS14097、BS13056，分别从来自河南、四川、安徽的标本中分离获得；第二亚类包括5个菌株，即BS13048、BS12061、BS12058、BS12066和BS14093，分别从来自内蒙古、甘肃、河北、云南的标本中分离获得。PG Ⅲ仅包括从2011年西藏采集的标本上分离的BS11085菌种，它与其他2个聚类在PGⅠ的西藏地区菌株BS11086和BS11087的遗传距离较大。仅有从2013年内蒙古呼和浩特市采集标本中分离获得BS13044聚类在PG Ⅳ，与另一个来自同一采集地点菌株BS13048之间亲缘关系较远。
3 结论与讨论
目前尚未有证据表明P.graminea能在寄主病残体上存活。在自然界中很少见到P.graminea有性世代的产孢结构。在病原菌侵染循环中，其无性世代D.graminea分生孢子起主要作用。在大麦抽穗时病叶上产生分生孢子，被风吹到附近大麦穗上并侵入发育中的种子[11]。但在病原菌漫长的进化过程中，为了适应自然环境胁迫以及与寄主植物的互作常引起遗传变异的发生。目前已发现的大麦抗条纹病基因较少，仅在大麦种质资源中发现2个具有小种专化性的抗条纹病基因，即来源于野生大麦（Hordeum spontaneum）抗条纹病基因Rdg1a和来自普通大麦（H.vulgare）抗病基因Rdg2a[12]。因此，寄主抗病性对P.graminea遗传变异也构成一定的选择压力。 分析病原菌群体遗传变异以及据此划分的遗传类群有助于及时了解病原菌群体区域分布、组成变化以及毒性变异等。已经利用多种技术分析麦类核腔菌群体的遗传多样性，如利用RAPD技术分析来自甘肃省不同地区菌株的遗传多态性，发现菌株间遗传距离与大麦品种类型、分布区域以及毒性强弱有相关性[4]，而何智宏利用筛选出的30对多态性RAPD引物将20个大麦条纹病菌株划分为4类，不同地理来源菌株存在一定的遗传差异[13]，以及ITS区SNP分析[5]、ITSRFLP[6]和IRAP[7]等。在本研究中，利用8对选择性AFLP引物组合对来自10个省份的19份P.graminea菌株基因组PCR扩增，进行遗传变异分析，共获得144条可统计的条带，其中112条呈多态性，多态性条带占77.8%。因此，与其他研究基因组指纹图谱的方法相比，AFLP更能高效准确揭示病原真菌群体遗传多样性。同时发现，19份P.graminea菌株间存在一定水平的遗传多样性，在相似系数为0.83时，可将19个菌株聚类成4个类群，大多数菌株分布在类群Ⅰ和类群Ⅱ中，而在类群Ⅲ和类群Ⅳ中各包含1个菌株，而且与其他2个类群中的成员遗传距离较大。在对玉米圆斑病菌（Bipolaris zeicola）的遗传多态性ISSR分析中，将24个菌株划分为6个类群（相似系数=0.91）[14]。总体而言，与上述研究中玉米圆斑病菌群体类似，目前我国大麦条纹病菌群体遗传多样性水平较低。在聚类分析中，部分来自同一地区或同一采集地块的菌株遗传距离较近，如来自甘肃武威市凉州区黄羊镇和古浪县BS12061和BS12058菌株间相似系数为0.99；来自安徽省农科院作物所试验地的BS14094和BS14097菌株间以及西藏自治区江孜县冲堆乡和拉萨市惟龙德庆县乃琼镇BS11086和BS11087菌株间遗传距离较近。但也存在分别来自不同大麦种植区域的菌株间亲缘关系较近的现象，如来自浙江省农业科学院试验地（杭州市）BS14029菌株与来自云南省大理州鹤庆县云鹤镇BS13006菌株亲缘关系较近。同时还存在来自同一大麦种植地区的菌株间有较大遗传变异的现象，例如BS11085、BS11086和BS11087三个菌株来自我国西藏自治区青稞种植区，但分属于类群Ⅲ和类群Ⅰ；来自内蒙古自治区农牧科学院试验地（呼和浩特市）菌株BS13044和BS13048分别聚类在PG Ⅳ和PGⅡ，且遗传距离较远。因此，我国大麦条纹病菌群体中存在一定程度的遗传变异，而且菌株间亲缘关系远近与其分布地域无明显规律，缺乏明显相关性，这可能与大麦、青稞各种植区域间品种调拨、穿梭育种、品种区试或育种亲本材料等频繁相互交流有关，病原菌随种子可以在我国各大麦或青稞种植区域实现远距离大范围传播。
大麦条纹病菌群体遗传多样性丰富度以及毒性的变异为大麦抗条纹病遗传资源筛选和抗病育种提出了挑战。我国大麦种植历史悠久，而且不同大麦种植区自然生态环境、栽培习惯、种植制度以及主栽品种组成和类型等均存在很大差异。另外，目前在大麦抗病育种中已注意增强抗条纹病基因资源的发掘和利用。这些因素有利于促进大麦条纹病菌遗传变异和毒性变化的发生。因此需要更深入研究并明确我国大麦（包括青稞）种植生态区域当地P.graminea基因型和主要毒性类型，从而为抗病种质资源筛选鉴定以及抗病育种提供技术支撑。
参考文献
[1] 陈健， 乔海龙， 陈和， 等. 大麦病害及其特征[J]. 江西农业学报， 2009， 21（5）： 7780.
[2] 郑果. 大麦条纹病病原菌及防治研究[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2011.
[3] Bembelkacem A， Boulif M， Amri A， et al. Variation in the pathogenicity of 20 Algerian isolates of Pyrenophora graminea Ito
关键词 大麦； 条纹病； 麦类核腔菌； AFLP标记； 聚类分析
中图分类号： S 435.123
文献标识码： A
大麦条纹病是通过种子传播的系统性侵染真菌病害，病原菌无性阶段为禾内脐蠕孢[Drechslera graminea（Rabenh. ex Schl.）Shoemaker，异名Helminthosporium gramineum Rabenh.]，有性阶段为麦类核腔菌[Pyrenophora graminea （Rabenk.） Ito et Kurib.]。该病害在世界各大麦种植区域均有分布，曾在我国长江流域地区如江苏、上海、浙江和四川等省（市）危害较重，发病严重地块病株率可达30%～40%[1]。近年来，采用新型的种子处理杀菌剂能有效地防治大麦条纹病，但种子药剂处理技术在甘肃、云南、西藏和青海等部分大麦、青稞种植区域还未得到普及或不能有效应用，这些地区的条纹病还很严重。
麦类核腔菌群体在生物学形态特征、毒性和DNA多态性等方面存在差异，并存在毒性变异和生理分化现象，不同菌株间毒性差异较大。在叙利亚和阿尔及利亚的调查中发现，不同毒性菌株的分布具有明显的地域特征[23]。Arabi等通过有性杂交研究了条纹病菌毒性变异的遗传特征，认为其毒性由1个显性基因控制[4]。郑果利用随机扩增多态性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分子标记技术分析了来自甘肃省不同地区的11个菌株的遗传多样性，发现菌株间遗传距离与大麦品种类型、分布区域以及毒性强弱有相关性[2]。吴宽然对来自我国11个省份579个条纹病菌菌株基因组ITS进行扩增测序，共检测到13个SNP变异位点和15种变异类型，同时发现菌株之间的毒性差异较大，即使来源于同一地区同一品种的同一变异类型的菌株，其毒性也不相同[5]。Arabi等在利用ITSRFLP技术对来源于叙利亚不同地区的56个菌株的DNA多态性分析中发现，叙利亚P.graminea群体具有较高的遗传多样性[6]，此外还比较了IRAP（interretrotransposon amplified polymorphism）和ITSRFLP分析大麦条纹病菌的遗传多样性的效率[7]。
本研究利用AFLP 技术，对19个来自我国不同大麦种植地区的大麦条纹病菌进行分析，明确我国各大麦、青稞产区条纹病菌在DNA水平的遗传变异及地区间相互交流情况，进而为研究病原菌的毒性变异和有效防控提供参考信息。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
2012-2014年，从我国各大麦及青稞种植地区采集大麦条纹病典型病株标样，利用组织分离法[10]从典型病叶组织中分离病原菌，将灭菌的滤纸片（4.5 mm × 4.5 mm）与病原菌在PDA平板上共培养，直到菌落长满培养皿，收集滤纸片于灭菌2次的硫酸纸袋中，室温条件下脱水干燥2～3 d后长期保存于-20℃冰箱中。将表面消毒后的感病叶片组织保湿培养，待病组织上产生分生孢子后利用显微镜进行形态学鉴定，同时挑取单个分生孢子，获得其纯培养物。本研究中所用的菌株均经rDNAITS扩增并测序，与NCBI数据库中P.graminea的rDNAITS序列进行比对验证，确认分离病原菌确为P.graminea。供试大麦条纹病菌菌株信息列于表1。
1.2 DNA提取
将供试菌株接种在直径9 cm 的PDA平板上，在室温条件下培养，每天定时打开培养架日光灯管，补充散射光4 h，每个菌株培养2皿，在菌落长满平板后打开培养皿盖，覆盖双层纱布后室温条件下干燥2～4 d，从培养基平板上刮取并收集菌丝，置于1个2 mL EP管中液氮中保存备用。采用CTAB法提取P.graminea基因组DNA。每个样品在液氮中充分研磨后加入0.65 mL 改良的DNA提取液[0.01 mol/L pH 8.0 TrisHCl 缓冲液中含2% （W/V） CTAB，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2%（V/V）巯基乙醇]。通过0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测，DNA样品无降解且带型整齐，杂质很少。经紫外分光光度法检测A260 nm/A280 nm比值为1.8～2.0，DNA样品纯度较高。
1.3 PCR模板制备
利用分光光度计NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）测定样品DNA的浓度，并稀释到500.0 ng/μL，-20℃保存备用。利用PstⅠ和MseⅠ限制性内切酶对供试菌株的基因组DNA样品进行双酶切，37℃水浴3 h。反应体系为20 μL，包括基因组DNA 500 ng，Pst Ⅰ酶（10 U/μL）0.5 μL，Mse Ⅰ酶（10 U/μL）0.5 μL，10×Tango缓冲液2.0 μL，补加ddH2O至20 μL。酶切产物直接进行连接反应。连接接头的反应体系包括：酶切产物5. 0 μL，PstⅠ接头（5 pmol/μL）1.0 μL，MseⅠ接头（50 pmol/μL）1.0 μL，10×连接缓冲液2.0 μL，T4DNA 连接酶（5 U/μL）0.5 μL，补加ddH2O至20 μL。37℃连接反应3 h，连接完成后，取5 μL连接产物在1.0%琼脂糖凝胶上检测酶切连接结果，酶切连接产物片段电泳后从上至下呈均匀的“弥散”状分布，说明DNA样品酶切彻底；取1.0 μL酶切连接产物作为PCR模板，利用一对预扩增引物进行PCR扩增，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后从上至下也呈均匀的“弥散”状，说明制备的菌株基因组DNA模板符合AFLP分析后续试验的要求。PCR扩增接头（表2）由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。双链DNA接头合成：将10.0 μmol/L PstⅠ单链接头，100 μmol/L MseⅠ单链接头等体积混合后95℃变性5 min，37℃复性10 min，分别合成浓度为5 pmol/μL和50 pmol/μL双链接头，贮存在-20℃。 1.4 PCR扩增
选用1对预扩增引物和32对选择性扩增引物， 以大麦条纹病菌基因组DNA样品酶切连接产物为PCR模板，进行AFLP片段多态性扩增（表3），所用引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
预扩增PCR反应体系为20 μL，包括：连接产物 2.0 μL，PstⅠG（5 pmol/μL）1.0 μL，MseⅠC（5 pmol/μL）1.0 μL，10×Easy Taq缓冲液2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.6 μL，Easy Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，加ddH2O至20 μL。预扩增PCR反应程序：94℃ 3 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃10 min，4℃ 30 min。反应结束后取5 μL预扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上检测结果，部分预扩增产物稀释50倍用于下一步选择性扩增，剩余预扩增产物置于-20℃冰箱中保存备用。
选择性扩增PCR反应体系为20 μL，包括：DNA模板（即预扩增PCR产物）5.0 μL，PstⅠ选择性引物（5 pmol/μL）2.0 μL，MseⅠ选择性引物（5 pmol/μL）2.0 μL，10×Easy Taq缓冲液2.0 μL，dNTPs （2.5 mmol/L 0.8 μL，Easy Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，加ddH2O至20 μL。选择性扩增PCR反应程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，12个循环，每个循环退火温度降低0.7℃；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 1 min，23个循环；72℃ 10 min，4℃ 30 min。
1.5 PCR产物电泳检测
选择性PCR产物样品3 μL经浓度为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测，电泳恒定功率P=85 W，I=200 mA，预电泳30 min，使得玻璃板的温度达到50℃左右，加样品后电泳约1 h。银染显色后，将凝胶平板放在室内晾干，然后扫描图片保存，统计清晰的电泳条带。
1.6 数据统计分析
采用二进位制记录，在扩增的相同位点处依据条带的有无分别记做1和0，并将统计结果用统计分析软件NTSYSpc 2.2计算材料间的遗传距离，再用非加权配对算术平均法（UPGMA）对遗传相似系数进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 大麦条纹病菌分离与纯化
大麦条纹病菌不同菌株在PDA平板上菌落生长速度、颜色和形态略有不同，如图1所示19个菌株中菌落形态特征具有代表性的6个菌株。培养2周后，菌落直径范围2.6～5.4 cm，多数菌落为圆形，菌落正面为白色、浅黄色或浅灰色，有的菌落边缘呈橘红色，中央略隆起，絮状，菌丝发达，但疏密程度略有差异；背面对应隆起部位呈青褐色、灰黑色或浅橘红色，其边缘部位呈浅黄色或粉红色。其他13个菌株的菌落在PDA平板上正面呈白色或浅灰色，背面呈褐色或灰黑色，菌落边缘呈白色或浅黄色。菌落生长速率、菌丝疏密程度等性状与图1中所示菌株类似。随着培养时间延长，菌落颜色也会变化，一般会加深变暗，呈灰黑色或深褐色。
2.2 PCR扩增结果
本实验室前期预备试验中比较了不同预扩增引物扩增效果，选择其中1对AFLP预扩增引物（PstⅠG MseⅠC），并从32对AFLP选择性扩增引物中筛选出8对引物，对供试的大麦条纹病菌的全基因组DNA进行片段长度多态性扩增，获得了较好的扩增结果（图2）。共扩增出144条谱带，片段大小67～501 bp，其中112条具有多态性，占总数77.8%，平均每对引物组合能扩增出18条可统计的条带，其中14条条带具有多态性（表4）。
2.3 多态性聚类分析
对供试的19份大麦条纹病菌菌株的AFLP遗传多态性聚类分析表明，菌株间相似系数分布在0.60～0.99之间（图3）。可以看出，以相似系数0.83为标准，将19份大麦条纹病菌可分4个类群（P.graminea groups，PGs）：PGⅠ中7个菌株分为两个亚类，第一亚类包括6个菌种，即BS14029、BS13006、BS12072、BS11086、BS11087和BS12073，分别从来自浙江、云南、青海、西藏采集的条纹病标本上分离获得；第二亚类包括1个菌种即BS12064，是自2012年河北廊坊试验地采集的标本中分离得到的菌株。PGⅡ包括10个菌株，聚类成2个亚类：第一亚类包括5个菌株，即BS13031、BS13057、BS14094、BS14097、BS13056，分别从来自河南、四川、安徽的标本中分离获得；第二亚类包括5个菌株，即BS13048、BS12061、BS12058、BS12066和BS14093，分别从来自内蒙古、甘肃、河北、云南的标本中分离获得。PG Ⅲ仅包括从2011年西藏采集的标本上分离的BS11085菌种，它与其他2个聚类在PGⅠ的西藏地区菌株BS11086和BS11087的遗传距离较大。仅有从2013年内蒙古呼和浩特市采集标本中分离获得BS13044聚类在PG Ⅳ，与另一个来自同一采集地点菌株BS13048之间亲缘关系较远。
3 结论与讨论
目前尚未有证据表明P.graminea能在寄主病残体上存活。在自然界中很少见到P.graminea有性世代的产孢结构。在病原菌侵染循环中，其无性世代D.graminea分生孢子起主要作用。在大麦抽穗时病叶上产生分生孢子，被风吹到附近大麦穗上并侵入发育中的种子[11]。但在病原菌漫长的进化过程中，为了适应自然环境胁迫以及与寄主植物的互作常引起遗传变异的发生。目前已发现的大麦抗条纹病基因较少，仅在大麦种质资源中发现2个具有小种专化性的抗条纹病基因，即来源于野生大麦（Hordeum spontaneum）抗条纹病基因Rdg1a和来自普通大麦（H.vulgare）抗病基因Rdg2a[12]。因此，寄主抗病性对P.graminea遗传变异也构成一定的选择压力。 分析病原菌群体遗传变异以及据此划分的遗传类群有助于及时了解病原菌群体区域分布、组成变化以及毒性变异等。已经利用多种技术分析麦类核腔菌群体的遗传多样性，如利用RAPD技术分析来自甘肃省不同地区菌株的遗传多态性，发现菌株间遗传距离与大麦品种类型、分布区域以及毒性强弱有相关性[4]，而何智宏利用筛选出的30对多态性RAPD引物将20个大麦条纹病菌株划分为4类，不同地理来源菌株存在一定的遗传差异[13]，以及ITS区SNP分析[5]、ITSRFLP[6]和IRAP[7]等。在本研究中，利用8对选择性AFLP引物组合对来自10个省份的19份P.graminea菌株基因组PCR扩增，进行遗传变异分析，共获得144条可统计的条带，其中112条呈多态性，多态性条带占77.8%。因此，与其他研究基因组指纹图谱的方法相比，AFLP更能高效准确揭示病原真菌群体遗传多样性。同时发现，19份P.graminea菌株间存在一定水平的遗传多样性，在相似系数为0.83时，可将19个菌株聚类成4个类群，大多数菌株分布在类群Ⅰ和类群Ⅱ中，而在类群Ⅲ和类群Ⅳ中各包含1个菌株，而且与其他2个类群中的成员遗传距离较大。在对玉米圆斑病菌（Bipolaris zeicola）的遗传多态性ISSR分析中，将24个菌株划分为6个类群（相似系数=0.91）[14]。总体而言，与上述研究中玉米圆斑病菌群体类似，目前我国大麦条纹病菌群体遗传多样性水平较低。在聚类分析中，部分来自同一地区或同一采集地块的菌株遗传距离较近，如来自甘肃武威市凉州区黄羊镇和古浪县BS12061和BS12058菌株间相似系数为0.99；来自安徽省农科院作物所试验地的BS14094和BS14097菌株间以及西藏自治区江孜县冲堆乡和拉萨市惟龙德庆县乃琼镇BS11086和BS11087菌株间遗传距离较近。但也存在分别来自不同大麦种植区域的菌株间亲缘关系较近的现象，如来自浙江省农业科学院试验地（杭州市）BS14029菌株与来自云南省大理州鹤庆县云鹤镇BS13006菌株亲缘关系较近。同时还存在来自同一大麦种植地区的菌株间有较大遗传变异的现象，例如BS11085、BS11086和BS11087三个菌株来自我国西藏自治区青稞种植区，但分属于类群Ⅲ和类群Ⅰ；来自内蒙古自治区农牧科学院试验地（呼和浩特市）菌株BS13044和BS13048分别聚类在PG Ⅳ和PGⅡ，且遗传距离较远。因此，我国大麦条纹病菌群体中存在一定程度的遗传变异，而且菌株间亲缘关系远近与其分布地域无明显规律，缺乏明显相关性，这可能与大麦、青稞各种植区域间品种调拨、穿梭育种、品种区试或育种亲本材料等频繁相互交流有关，病原菌随种子可以在我国各大麦或青稞种植区域实现远距离大范围传播。
大麦条纹病菌群体遗传多样性丰富度以及毒性的变异为大麦抗条纹病遗传资源筛选和抗病育种提出了挑战。我国大麦种植历史悠久，而且不同大麦种植区自然生态环境、栽培习惯、种植制度以及主栽品种组成和类型等均存在很大差异。另外，目前在大麦抗病育种中已注意增强抗条纹病基因资源的发掘和利用。这些因素有利于促进大麦条纹病菌遗传变异和毒性变化的发生。因此需要更深入研究并明确我国大麦（包括青稞）种植生态区域当地P.graminea基因型和主要毒性类型，从而为抗病种质资源筛选鉴定以及抗病育种提供技术支撑。
参考文献
[1] 陈健， 乔海龙， 陈和， 等. 大麦病害及其特征[J]. 江西农业学报， 2009， 21（5）： 7780.
[2] 郑果. 大麦条纹病病原菌及防治研究[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2011.
[3] Bembelkacem A， Boulif M， Amri A， et al. Variation in the pathogenicity of 20 Algerian isolates of Pyrenophora graminea Ito