鲤鱼属于变温生物，其对外界环境温度较为敏感，外界环境对其生长有重要影响。在低温环境下，一些源于热带的鱼类，如罗非鱼、鲮鱼等对环境温度非常敏感，在温带以北地区的水域根本无法安全越冬。随着生物学、生态学等学科的发展，对于鱼类如何适应外界环境的研究成果越来越多。本文以鲤鱼的抗寒研究为例，分析抑制消减杂交技术的应用。
　　1 概述
　　抑制消减杂交技术（SSH）是由Diatchenko 等于1996年发明的一种以信使RNA差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术，主要基于新出现的抑制PCR，结合标准化和消减杂交。通过含引物序列的双链接头作为引物模板，使两端接上同一接头的非目的双链片段具有反向末端重复序列，达到抑制非目的片段的目的。标准化平衡目的基因群中cDNA的丰度，消减杂交扣除目的基因群和驱赶基因群间的同源序列。
　　2 实验材料与方法
　　2.1 材料
　　本实验以某适合北方池塘养殖的抗寒类鲤鱼为研究对象，这些鲤鱼大小相差较小，在55～70克之间，且没有病害。该抗寒鲤鱼是杂交类鲤鱼，能长期在低温环境下生存。
　　2.2 方法
　　降温实验。将50尾健康的抗寒鲤鱼放入到室内控温水族箱中，温度为16℃，维持1天，然后在第二天早上8时进行一次采样，随机采5尾鱼提取肝脏、脑、肌肉等组织，并保存于液氮中。然后开始降温，以1℃/小时的速度降温，当温度降到10℃时，采5尾鱼的肝脏、脑、肌肉组织，并保存在液氮中，而剩下的40尾鱼继续在10℃的环境中生存，到第二天，再抽取五尾鱼的肝脏、脑、肌肉组织，依次类推，直到最后一天鱼全部采完。然后将水族箱的温度提高到16℃，开始第二阶段的降温实验。挑选40尾鱼放入到16℃的水族箱中，维持1天。在第二天早上8时开始降温，直到降到10℃停止。到第二天早上8时开始，从10℃逐渐降到4℃，降温速度与第一阶段相同。到4℃后，每天采5尾鱼进行实验，直到采完为止。
　　总RNA的提取。选择10℃和4℃时采的5尾鱼的脑组织样品为研究对象，将样品放入Trizol Reagent中，高速上下摇匀，直到看不见组织和细胞碎片。在室温环境下培育10分钟，接着加入适量的氯仿，劇烈震荡15秒，在室温下培育3分钟。4℃，在12 000转/分下离心15分钟，将上面的清液转移到另一个离心管中，并加入适量的异丙醇，混匀后静置10分钟。4℃，在12 000转/分下离心10分钟，去上清，加入适量的75%乙醇并混匀。4℃，在7 500转/分下离心5分钟，去上清，在空气中干燥，加入适量的DEPC-WATER，溶解沉淀，取少量的RNA，利用分光光度计检测其纯度和完整度，并置于零下80℃的冰箱中保存。
　　杂交。对每一个实验样品均进行消减杂交，将cDNA、杂交缓冲液、连有接头1的testerl-1和连有接头2的testerl-2合并到一盒0.5毫升的离心管中，并将其置于PCR仪上，在98℃下放置1分钟，接着将样品放置在68℃的环境下培育8小时，并进行下一步的杂交。将第一步杂交得到的两个样品混合到一起变成新的变性driver cDNA，将其与杂交缓冲液和去离子水混合到一起，并取出1微升的混合物到0.5毫升的离心管中，置于PCR仪上90℃变性90秒，然后将变性的driver cDNA取出，并将微量移液器调至15微升界面，小心的吸出所有的样品。将枪尖移出液面，吸入少量的空气，并在样品的下方形成气泡，接着重复前面的步骤，从管中取出新变性的driver，并将混合物转移到含有杂交样品1的管中，并进行离心，在68℃下过夜培育，然后往管中加入稀释液，摇匀，在PCR仪上68℃加热7分钟，最后储存到零下20℃的冰箱中。
　　实验结果。在鲤鱼的生命中，某种特定类型的细胞只有比例约为10%～15%的基因表达，这些基因的特异性使得鲤鱼从受精卵到生命机体死亡的全过程，故而其时空表达受到严格限制，在不同的发育状态，基因表现出不同的特点。自SSH技术被发明出来，其就因强特异性、低假阳性率、高敏感性、高消减效率而被广泛应用，在鱼类的基因克隆上也有应用。在鲤鱼抗寒研究中，其涉及到鲤鱼的神经调控系统、酶系统、生理调节系统等，抗寒类鲤鱼的基因表达呈现出上调特点，这说明运用SSH技术进行鲤鱼的抗寒研究是可行。