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基金项目：重庆教委科学技术研究项目（KJ101804）。
作者简介：李润琴（1977-），女，副教授，博士，主要从事干细胞及胚胎发育的研究。
通信作者：黄春（1969-），男，主任医师，硕士研究生，主要从事肝胆外科学的研究。
【摘 要】 目的：建立新生SD大鼠c-kit阳性细胞分离纯化及传代的培养方法。方法：取出生24h之内新生SD大鼠心尖部组织，用PBS液洗去心尖部的血液，将其剪碎成lmm3以下的组织块培养，培养48h后，0.5%Trypsin-EDTA消化，用免疫磁珠分选c-kit阳性的心肌细胞，继续培养传代。用倒置显微镜观察c-kit阳性心肌细胞，用免疫细胞化学法检测心肌组织特异性cTnT及Desmin蛋白。结果：用心脏组织培养法成功得到了体外搏动的原代心肌细胞；用免疫磁珠分选了c-kit阳性心肌细胞，倒置显微镜下观察到c-kit阳性心肌细胞具有传代增殖的特性；同时，检测了c-kit阳性心肌细胞胞质cTnT及Desmin结合蛋白的阳性表达。结论：采用改良后的培养方法获得了c-kit阳性心肌细胞，该细胞具有心肌干细胞的蛋白表达特性，并具有一定的传代增殖能力。
【关键词】 新生大鼠；c-kit阳性心肌细胞；分离纯化
【中图分类号】R33-33 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）18-0015-03
Separation and purification of c-kit+ myocardial cells in SD newborn rats
LI Run-qin，HUANG Chun
Chongqing Three Gorges Medical College，Chongqing municipality，Wangzhou 404020，China
Abstract：objective To establish a method about separation， purification and passage of c-kit+ myocardial cells in SD newborn rats.Method Cardiac apex that removed from newborn SD rat within 24 hours washed by PBS， and cut it about lmm3， cultivate after 48 hours，0.5% Trypsin-EDTA digestion， c-kit+ myocardial cells separated by positive immune magnetic bead ， continuing subculture.To observe the c-kit+ myocardial cell growth， and immunocytochemistry detection of cTnT and Desmin protein.Results Pulsatile primary cardiomyocytes in vitro have been successfully gotten with cardiac tissue culture method；c-kit+ myocardial cells have separated by positive immune magnetic bead， The passaged proliferation characteristics of c-kit-positive cardiac cells have been detected in an inverted microscope.Meanwhile，the positive expression of cTnT and Desmin in the cytoplasmic of c-kit-positive cardiac cells have been detected.Conclusion C-kit+ myocardial cells，with the protein expression characteristics of myocardial stem cell and the proliferation ability ，have been obtained by the cultivation of the improved method.
Keywords：Newborn rats；c-kit+ myocardial cells；Separation and purification
全世界每年失代偿心衰治疗花费高达1200亿美元，5年死亡率50%左右。心肌梗死是全球致死和致残的主要疾病之一。以2011年为例，中国有50～60万急性心肌梗死患者。β-阻滞剂、ACEI和醛固酮受体拮抗剂等药物旨在减少心肌缺血损伤；心脏同步化治疗以及辅助装置等旨在减少心衰死亡率，改善患者生活质量；对于心衰患者，心脏的再生治疗才能保留正常心肌功能。迄今心脏移植才是唯一有效治疗手段。然而，全球心脏移植供体短缺是巨大障碍。随着新的治疗手段的探索，10年前多能干细胞已经应用于心脏再生治疗。近期，科学家们发现了人的心脏中有可分化为所有主要心脏细胞的干细胞，心肌损伤的患者在损伤的心肌处注射体外培养的心肌干细胞，可以治疗缺血性心肌病。该发现为自体细胞用于受损心脏的治疗开辟了一条新的道路。目前干细胞移植正处于技术瓶颈阶段，干细胞移植的效果在多数研究中基本上得到了肯定，但是还存在许多急待解决的问题，如干细胞治疗各种疾病的确切机制、移植后的远期效果等尚不清楚。本课题做为此研究方向的基础性工作，致力于建立一种简单有效的、重复性好的，对具有心肌干细胞蛋白表达特性的心肌细胞的分离培养的方法。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 性成熟SD大鼠（1只雄鼠、1只雌鼠）购自重庆医科大学实验动物中心。饲养2周，产7只新生大鼠，取24小时之内新生大鼠实验。
1.1.2 试剂 cTnT、GATA4抗体购自santa cruz公司。低糖DMEM、胎牛血清、Trypsin-EDTA和PBS培养基购自Gibco公司。c-kit免疫磁珠购自Miltenyi公司。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞培养 将新生大鼠用75%酒精消毒后，打开胸腔，剪取心尖部，用PBS反复冲洗，将其剪碎成1mm3以下的组织块，铺平在细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。组织块贴壁约2～3h后，补加含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养，48h后观察记录。
1.2.2 免疫磁珠分选c-kit阳性心肌细胞 取培养48h的原代心肌细胞用0.5%Trypsin-EDTA消化，上分离柱前，充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块。用分离柱分选，真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞。将c-kit抗体接上磁珠，再将心肌细胞悬液加入分离柱（有c-kit抗体的磁珠将会抓住c-kit阳性的细胞，c-kit阴性的细胞则被分离），移除磁场，收集c-kit阳性细胞。
1.2.3 c-kit阳性心肌细胞传代 免疫磁珠分选c-kit阳性心肌细胞后，继续体外培养生长5d，细胞增殖可进行传代（弃去培养瓶中培养液，PBS洗2～3次，加入0.5%Trypsin-EDTA消化2min，镜下见细胞收缩变圆，立即加入等体积培养液终止消化。反复用吸管吸取瓶底液体吹打培养瓶壁，使附壁细胞脱落形成细胞悬液。将悬液移至离心管，于1000r/min转速下离心3min，弃去上清，继续培养）。
1.2.4 免疫细胞化学法检测心肌细胞 取细胞爬片，进行cTnT免疫细胞化学反应。用37℃ PBS（PH=7.2）反复冲洗3次。每次3分钟。–20℃丙酮固定10min，自然干燥。每张加50μl过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS液反复冲洗3次，每次2min。除去PBS液，加50μl10%山羊血清，室温下孵育10min。除去血清，分别加100μl一抗Desmin（1∶50），cTnT（1∶400）完全覆盖待检组织，室温下孵育2小时。PBS液反复冲洗，除去PBS液，分别加入100μl辣根过氧化物酶标记链亲和素。室温下孵育10min。加入100μl DAB显色液。自来水反复冲洗，苏木素复染，自来水再次冲洗反蓝。经梯度酒精脱水（70%、80%、90%酒精：2min×1次，95%酒精：2min×2次，100%酒精：2min×3次），二甲苯（二甲苯Ⅰ：2min×1次，二甲苯Ⅱ：2min×1次）透明，干燥，中性树胶封片。阴性对照以PBS代替一抗作为阴性对照。
2 结果
2.1 心肌细胞形态 原代心肌组织植入培养瓶后，2d可见有细胞自心肌组织边缘爬出，并可见成簇的心肌细胞搏动（图1）。免疫磁珠分选c-kit阳性的心肌细胞，传代培养可见细胞继续分裂（图2）。
2.2 心肌细胞胞质Desmin和cTnT表达 免疫磁珠分选c-kit阳性心肌细胞传代培养后，胞浆呈现棕黄色，Desmin和cTnT呈阳性表达，Desmin和cTnT有较高的心肌细胞特异性（图3）。
3 讨论
2011年11月14日英国《柳叶刀》在线发布的研究报告说，美国研究人员用心脏干细胞治疗心肌梗塞的临床试验获得成效。美国路易斯维尔大学等机构的研究人员报告说，有16名心肌梗塞患者接受了干细胞疗法，研究人员在试管中对获得的干细胞进行了培养，在约4个月后将培养所得的大量干细胞注射回其主人的心脏中，期待它们成长为新的健康心脏组织。结果显示，这些患者由于心肌受损，左心室在一次心跳中将血液正常压出心室的几率原本已降到30.3%，但在接受干细胞治疗后，这一比例已升至38.5%。如果后续研究能进一步支持这种心脏干细胞疗法的有效性，可能会成为心血管医疗领域的重大进步[1-2]。
多个研究小组都表明，心肌的多数成分均可由心外来源的祖细胞分化而来，但不同细胞类型其再生率差别极大。而不幸的是，心肌细胞再生率最低。采用组织培养法获取细胞，可避免细胞因长时间消化造成的损伤，减少了杂细胞的干扰，并且可以在同一组织块中周期性的获得细胞，提高了心肌标本的利用率。
c-kit是经典的干细胞表面标志之一，c-kit+细胞在人体中存在是较为肯定的。当然，目前鉴别心肌干细胞的方法尚缺乏统一标准，心脏特异性标记蛋白还有GATA4，MEF2C，Nkx2.5/Csx等等[3]。Dawn等研究表明在增殖潜能和心肌修复方面，c-kit+心肌干细胞要明显强于Sca-1+的心肌干细胞[4]。尽管有人持有不同观点[5]，但在确定有助于修复受损心脏的多能干细胞中，鉴别出真正的祖细胞是非常必要的。因此本实验选取c-kit作为纯化和鉴定具有心肌干细胞特性的表面标记。本实验用免疫磁珠分离新生SD大鼠心肌细胞中的c-kit+细胞，在倒置显微镜下观察到c-kit+细胞分裂，并继续培养传代。结果证明用免疫磁珠可以分选具有心肌干细胞特征表型的心肌细胞。用免疫细胞化学法证明了心肌细胞的特异性标记物Desmin和cTnT的阳性表达。本次实验仅仅鉴别了c-kit+心肌细胞，尚属基础性工作，课题组将沿着此方向继续培养并鉴定增殖分化成熟的心肌干细胞。
参考文献
[1]Bolli R，Chugh AR，D’Amario D，et al.Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy（SCIPIO）：initial results of a randomised phase 1 trial[J].Lancet，2011，378（9806）：1847-1857.
[2]Chugh AR，Beache GM，Loughran JH，et al.Administration of cardiac stem cells in patients with ischemic cardiomyopathy： the SCIPIO trial：surgical aspects and interim analysis of myocardial function and viability by magnetic resonance[J].Circulation.，2012，126（1）：54-64.
[3]Antonio P.Beltrami，Laura Barlucchi，Daniele Torella，et al.Adult Cardiac Stem Cells Are Multipotent and Support Myocardial Regeneration[J].Cell，2003，114（6）：763-776.
[4]Dawn B，Stein AB，Urbanek K，et al.Cardiac stem cells deliv-ered intravascularly traverse the vessel barrier， regenerate in-farcted myocardium， and improve cardiac function[J].ProcNatl Acad Sci USA，2005，102：3766-3771.
[5]Cheng K，Blusztajn A，Shen D，et al.Functional performance of human cardiosphere-derived cells delivered in an in situ polymerizable hyaluronan-gelatin hydrogel[J].Biomaterials，2012，33（21）：5317-5324.
（收稿日期：2014.07.04）
作者简介：李润琴（1977-），女，副教授，博士，主要从事干细胞及胚胎发育的研究。
通信作者：黄春（1969-），男，主任医师，硕士研究生，主要从事肝胆外科学的研究。
【摘 要】 目的：建立新生SD大鼠c-kit阳性细胞分离纯化及传代的培养方法。方法：取出生24h之内新生SD大鼠心尖部组织，用PBS液洗去心尖部的血液，将其剪碎成lmm3以下的组织块培养，培养48h后，0.5%Trypsin-EDTA消化，用免疫磁珠分选c-kit阳性的心肌细胞，继续培养传代。用倒置显微镜观察c-kit阳性心肌细胞，用免疫细胞化学法检测心肌组织特异性cTnT及Desmin蛋白。结果：用心脏组织培养法成功得到了体外搏动的原代心肌细胞；用免疫磁珠分选了c-kit阳性心肌细胞，倒置显微镜下观察到c-kit阳性心肌细胞具有传代增殖的特性；同时，检测了c-kit阳性心肌细胞胞质cTnT及Desmin结合蛋白的阳性表达。结论：采用改良后的培养方法获得了c-kit阳性心肌细胞，该细胞具有心肌干细胞的蛋白表达特性，并具有一定的传代增殖能力。
【关键词】 新生大鼠；c-kit阳性心肌细胞；分离纯化
【中图分类号】R33-33 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）18-0015-03
Separation and purification of c-kit+ myocardial cells in SD newborn rats
LI Run-qin，HUANG Chun
Chongqing Three Gorges Medical College，Chongqing municipality，Wangzhou 404020，China
Abstract：objective To establish a method about separation， purification and passage of c-kit+ myocardial cells in SD newborn rats.Method Cardiac apex that removed from newborn SD rat within 24 hours washed by PBS， and cut it about lmm3， cultivate after 48 hours，0.5% Trypsin-EDTA digestion， c-kit+ myocardial cells separated by positive immune magnetic bead ， continuing subculture.To observe the c-kit+ myocardial cell growth， and immunocytochemistry detection of cTnT and Desmin protein.Results Pulsatile primary cardiomyocytes in vitro have been successfully gotten with cardiac tissue culture method；c-kit+ myocardial cells have separated by positive immune magnetic bead， The passaged proliferation characteristics of c-kit-positive cardiac cells have been detected in an inverted microscope.Meanwhile，the positive expression of cTnT and Desmin in the cytoplasmic of c-kit-positive cardiac cells have been detected.Conclusion C-kit+ myocardial cells，with the protein expression characteristics of myocardial stem cell and the proliferation ability ，have been obtained by the cultivation of the improved method.
Keywords：Newborn rats；c-kit+ myocardial cells；Separation and purification
全世界每年失代偿心衰治疗花费高达1200亿美元，5年死亡率50%左右。心肌梗死是全球致死和致残的主要疾病之一。以2011年为例，中国有50～60万急性心肌梗死患者。β-阻滞剂、ACEI和醛固酮受体拮抗剂等药物旨在减少心肌缺血损伤；心脏同步化治疗以及辅助装置等旨在减少心衰死亡率，改善患者生活质量；对于心衰患者，心脏的再生治疗才能保留正常心肌功能。迄今心脏移植才是唯一有效治疗手段。然而，全球心脏移植供体短缺是巨大障碍。随着新的治疗手段的探索，10年前多能干细胞已经应用于心脏再生治疗。近期，科学家们发现了人的心脏中有可分化为所有主要心脏细胞的干细胞，心肌损伤的患者在损伤的心肌处注射体外培养的心肌干细胞，可以治疗缺血性心肌病。该发现为自体细胞用于受损心脏的治疗开辟了一条新的道路。目前干细胞移植正处于技术瓶颈阶段，干细胞移植的效果在多数研究中基本上得到了肯定，但是还存在许多急待解决的问题，如干细胞治疗各种疾病的确切机制、移植后的远期效果等尚不清楚。本课题做为此研究方向的基础性工作，致力于建立一种简单有效的、重复性好的，对具有心肌干细胞蛋白表达特性的心肌细胞的分离培养的方法。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 性成熟SD大鼠（1只雄鼠、1只雌鼠）购自重庆医科大学实验动物中心。饲养2周，产7只新生大鼠，取24小时之内新生大鼠实验。
1.1.2 试剂 cTnT、GATA4抗体购自santa cruz公司。低糖DMEM、胎牛血清、Trypsin-EDTA和PBS培养基购自Gibco公司。c-kit免疫磁珠购自Miltenyi公司。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞培养 将新生大鼠用75%酒精消毒后，打开胸腔，剪取心尖部，用PBS反复冲洗，将其剪碎成1mm3以下的组织块，铺平在细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。组织块贴壁约2～3h后，补加含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养，48h后观察记录。
1.2.2 免疫磁珠分选c-kit阳性心肌细胞 取培养48h的原代心肌细胞用0.5%Trypsin-EDTA消化，上分离柱前，充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块。用分离柱分选，真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞。将c-kit抗体接上磁珠，再将心肌细胞悬液加入分离柱（有c-kit抗体的磁珠将会抓住c-kit阳性的细胞，c-kit阴性的细胞则被分离），移除磁场，收集c-kit阳性细胞。
1.2.3 c-kit阳性心肌细胞传代 免疫磁珠分选c-kit阳性心肌细胞后，继续体外培养生长5d，细胞增殖可进行传代（弃去培养瓶中培养液，PBS洗2～3次，加入0.5%Trypsin-EDTA消化2min，镜下见细胞收缩变圆，立即加入等体积培养液终止消化。反复用吸管吸取瓶底液体吹打培养瓶壁，使附壁细胞脱落形成细胞悬液。将悬液移至离心管，于1000r/min转速下离心3min，弃去上清，继续培养）。
1.2.4 免疫细胞化学法检测心肌细胞 取细胞爬片，进行cTnT免疫细胞化学反应。用37℃ PBS（PH=7.2）反复冲洗3次。每次3分钟。–20℃丙酮固定10min，自然干燥。每张加50μl过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS液反复冲洗3次，每次2min。除去PBS液，加50μl10%山羊血清，室温下孵育10min。除去血清，分别加100μl一抗Desmin（1∶50），cTnT（1∶400）完全覆盖待检组织，室温下孵育2小时。PBS液反复冲洗，除去PBS液，分别加入100μl辣根过氧化物酶标记链亲和素。室温下孵育10min。加入100μl DAB显色液。自来水反复冲洗，苏木素复染，自来水再次冲洗反蓝。经梯度酒精脱水（70%、80%、90%酒精：2min×1次，95%酒精：2min×2次，100%酒精：2min×3次），二甲苯（二甲苯Ⅰ：2min×1次，二甲苯Ⅱ：2min×1次）透明，干燥，中性树胶封片。阴性对照以PBS代替一抗作为阴性对照。
2 结果
2.1 心肌细胞形态 原代心肌组织植入培养瓶后，2d可见有细胞自心肌组织边缘爬出，并可见成簇的心肌细胞搏动（图1）。免疫磁珠分选c-kit阳性的心肌细胞，传代培养可见细胞继续分裂（图2）。
2.2 心肌细胞胞质Desmin和cTnT表达 免疫磁珠分选c-kit阳性心肌细胞传代培养后，胞浆呈现棕黄色，Desmin和cTnT呈阳性表达，Desmin和cTnT有较高的心肌细胞特异性（图3）。
3 讨论
2011年11月14日英国《柳叶刀》在线发布的研究报告说，美国研究人员用心脏干细胞治疗心肌梗塞的临床试验获得成效。美国路易斯维尔大学等机构的研究人员报告说，有16名心肌梗塞患者接受了干细胞疗法，研究人员在试管中对获得的干细胞进行了培养，在约4个月后将培养所得的大量干细胞注射回其主人的心脏中，期待它们成长为新的健康心脏组织。结果显示，这些患者由于心肌受损，左心室在一次心跳中将血液正常压出心室的几率原本已降到30.3%，但在接受干细胞治疗后，这一比例已升至38.5%。如果后续研究能进一步支持这种心脏干细胞疗法的有效性，可能会成为心血管医疗领域的重大进步[1-2]。
多个研究小组都表明，心肌的多数成分均可由心外来源的祖细胞分化而来，但不同细胞类型其再生率差别极大。而不幸的是，心肌细胞再生率最低。采用组织培养法获取细胞，可避免细胞因长时间消化造成的损伤，减少了杂细胞的干扰，并且可以在同一组织块中周期性的获得细胞，提高了心肌标本的利用率。
c-kit是经典的干细胞表面标志之一，c-kit+细胞在人体中存在是较为肯定的。当然，目前鉴别心肌干细胞的方法尚缺乏统一标准，心脏特异性标记蛋白还有GATA4，MEF2C，Nkx2.5/Csx等等[3]。Dawn等研究表明在增殖潜能和心肌修复方面，c-kit+心肌干细胞要明显强于Sca-1+的心肌干细胞[4]。尽管有人持有不同观点[5]，但在确定有助于修复受损心脏的多能干细胞中，鉴别出真正的祖细胞是非常必要的。因此本实验选取c-kit作为纯化和鉴定具有心肌干细胞特性的表面标记。本实验用免疫磁珠分离新生SD大鼠心肌细胞中的c-kit+细胞，在倒置显微镜下观察到c-kit+细胞分裂，并继续培养传代。结果证明用免疫磁珠可以分选具有心肌干细胞特征表型的心肌细胞。用免疫细胞化学法证明了心肌细胞的特异性标记物Desmin和cTnT的阳性表达。本次实验仅仅鉴别了c-kit+心肌细胞，尚属基础性工作，课题组将沿着此方向继续培养并鉴定增殖分化成熟的心肌干细胞。
参考文献
[1]Bolli R，Chugh AR，D’Amario D，et al.Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy（SCIPIO）：initial results of a randomised phase 1 trial[J].Lancet，2011，378（9806）：1847-1857.
[2]Chugh AR，Beache GM，Loughran JH，et al.Administration of cardiac stem cells in patients with ischemic cardiomyopathy： the SCIPIO trial：surgical aspects and interim analysis of myocardial function and viability by magnetic resonance[J].Circulation.，2012，126（1）：54-64.
[3]Antonio P.Beltrami，Laura Barlucchi，Daniele Torella，et al.Adult Cardiac Stem Cells Are Multipotent and Support Myocardial Regeneration[J].Cell，2003，114（6）：763-776.
[4]Dawn B，Stein AB，Urbanek K，et al.Cardiac stem cells deliv-ered intravascularly traverse the vessel barrier， regenerate in-farcted myocardium， and improve cardiac function[J].ProcNatl Acad Sci USA，2005，102：3766-3771.
[5]Cheng K，Blusztajn A，Shen D，et al.Functional performance of human cardiosphere-derived cells delivered in an in situ polymerizable hyaluronan-gelatin hydrogel[J].Biomaterials，2012，33（21）：5317-5324.
（收稿日期：2014.07.04）