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[摘要]目的 研究缬沙坦对兔耳增生性瘢痕形成的影响。方法16只新西兰兔随机分为4组，每只兔耳腹侧制作6个创面。高剂量治疗组：术后第21天开始给予缬沙坦8mg/（kg·d）口服治疗。低剂量治疗组：在术后第21天开始予缬沙坦4mg/（kg·d）口服治疗。阳性对照组：分别在术后第21天和28天时给予皮损内曲安奈德注射治疗。阴性对照组：不给于任何干预。在术后第42天时处死所有兔子，收集所有标本行苏木素-伊红染色和苦味酸天狼星红染色。结果高剂量治疗组的瘢痕增生指数（1.71±0.11）、成纤维细胞数量（438.15±50.01）、I型胶原百分比（41.94±2.29）、Ⅲ型胶原百分比（28.83±1.48）均低于阴性对照组（2.02±0.29），（612.08±106.59），（49.51±2.81），（29.80±1.39）；低剂量治疗组的I型及Ⅲ型胶原百分比（48.24±2.02），（29.05±1.10）均低于阴性对照组；阳性对照组的瘢痕增生指数（1.33±0.13）、成纤维细胞数量（233.08±62.32）、I型及Ⅲ型胶原百分比（36.42±2.41），（27.94±2.26）均低于高剂量治疗组。结论缬沙坦可以在一定程度上抑制兔耳瘢痕增生，高剂量治疗效果更佳。
[关键词]缬沙坦；曲安奈德；增生性瘢痕；兔耳瘢痕模型
皮肤病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，其形成及发展与遗传、治疗等诸多方面有着密切的联系，但主要的特征为成纤维细胞的过度增生和胶原蛋白代偿失调导致的异常堆积。由于其病因尚不清楚，目前临床上常使用的治疗方法（手术、药物、机械压迫、放射等）都无法完全令人满意。因此，其发病机制及治疗靶点的研究热度经久不衰。肾素一血管紧张素系统在各脏器纤维化过程中发挥重要作用，通过细胞培养研究，人们发现血管紧张素Ⅱ的1型受体（ATlR）拈抗剂氯沙坦能够抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的生长增殖及纤维链接蛋白的合成，提示ATlR拮抗剂可能对增生性瘢痕有防治作用。本研究通过动物实验进一步观察ATlR拮抗剂（缬沙坦）对增生性瘢痕的影响。
1.材料与方法
1.1材料
动物：16只新西兰兔（雌性，2000～2500g，清洁级，分笼饲养），购自广东省医学实验动物中心，饲养于汕头大学医学院实验动物中心，适应性饲养1周后使用。实验设计已通过汕头大学医学院动物实验伦理审查。仪器：Leica DMRXA2全能显微镜（德国Leica公司），Leica RM2235手动转轮切片机（德国Leica公司），CS-VI型摊片、烤片机（孝感市宏业医用仪器有限公司），Leica IM50图像采集系统（德国Leica公司），图像分析系统为Image-ProPlus（Media Cybernetics L.P.），偏振光显微镜（DMR显微镜，Leica）。药物：缬沙坦胶囊（北京诺华制药.有限公司），曲安奈得注射液（上海通用药业股份有限公司）。
1.2方法
使用戊巴比妥钠（1.5mg/kg）静脉麻醉新西兰兔，将兔耳腹侧展平后测量、描绘直径1cm圆形手术区域，每个手术区域间隔约1cm。使用10号手术刀片切开全层皮肤及软骨膜达软骨，蚊式血管钳沿创缘小心剥离全层皮肤及软骨膜。每只兔耳制备6个圆形缺损面，共192处，术后創面暴露，待其自行愈合。
1.3动物分组
按照随机数余数分组法分为4组，每组4只。高剂量治疗组：术后第21天开始予缬沙坦8mg/（kg·d）混悬液（溶剂为灭菌注射用水）灌胃，每天1次；低剂量治疗组：术后第21天开始予缬沙坦4mg/（kg·d）混悬液（溶剂为灭菌注射用水）灌胃，每天1次；阳性对照组：术后第21天和28天分别进行曲安奈德溶液0.1mL皮损内注射；阴性对照组：不给于任何干预。
1.4取材及标本制作
术后第42天，使用戊巴比妥钠（1.5mg/kg）静脉麻醉新西兰兔，切取所有创面标本（直径约1.2cm，圆形），每个标本沿正中线平均分为2份。标本置于10%甲醛溶液中固定、乙醇脱水、石蜡包埋、切片（厚度5um）后，进行HE染色和苦昧酸天狼星红染色。
1.5观察指标
（1）大体观察：术后第42天拍照记录创面情况，观察瘢痕的高度、颜色、质地。镜下观察：胶原纤维的排列、形态。（2）瘢痕增生指数，用测微尺测量兔耳瘢痕最高点至耳软骨表面的垂直厚度（a）、瘢痕周边正常皮肤至耳软骨表面的垂直厚度（b），计算得出瘢痕增生指数（HI=a/b）。（3）成纤维细胞数量：经苏木精一伊红染色制成瘢痕组织切片，按Weidner计数方法在400倍视野光镜下随机计数3个视野的成纤维细胞数量，每个视野由2位医师同时计数，求其平均值。（4）I、Ⅲ型胶原百分比：苦味酸天狼星红染色切片，在100倍偏振光显微镜下每张切片随机计数3个视野，采用Image-ProPlus6.0图像分析系统分别进行检测。I型胶原百分比=（红色区域面积+黄色区域面积）/总面积×100%；Ⅲ型胶原百分比=绿色区域面积/总面积×100%。
1.6统计学分析
采用SPSS16.0统计学软件进行统计分析，数据用（x±s）表示，符合正态分布和方差齐性的数据，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；不符合正态分布或方差齐性的数据，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，P<0.05表示具有统计学差异。
2.结果
2.1大体观察
阳性对照组：瘢痕平坦，颜色最浅，质地最软。高剂量治疗组：瘢痕较平，颜色略红，质地较软。低剂量治疗组和阴性对照组：瘢痕明显隆起，颜色较深，质地坚硬。
2.2镜下观察
阳性对照组：胶原纤维排列整齐，形态纤细。高剂量治疗组：胶原纤维排列欠整齐，形态较纤细。低剂量治疗组：胶原纤维排列紊乱，形态较粗。阴性对照组：胶原纤维排列紊乱，形态粗大。 2.3实验结果
（1）瘢痕增生指数。多组间比较差异有统计学意义。组间两两比较：高剂量治疗组、阳性对照组分别与阴性对照组比较有统计学差异。低剂量治疗组与阴性对照组比较无统计学差异（P=0.15）。（2）成纤维细胞数量。多组间比较差异有统计学意义。组间两两比较：高剂量治疗组、阳性对照组分别与阴性对照组比较有统计学差异。低剂量治疗组与阴性对照组比较无统计学差异（P=0.22）。（3）I型胶原百分比（%）。多组间比较差异有统计学意义。组间两两比较：高剂量治疗组、低剂量治疗组、阳性对照组分别与阴性对照组较有统计学差异。（4）Ⅲ型胶原百分比（%）。多组间比较差异有统计学意义。组间两两比较：高剂量治疗组分别与阳性对照组、阴性对照组比较有统计学差异；高劑量治疗组与低剂量治疗组比较无统计学差异（P=0.50）；低剂量治疗组分别与阳性对照组、阴性对照组比较有统计学差异（P<0.05）。见表1。
3.讨论
增生性瘢痕是由物理、机械、化学、生物等因素引起皮肤组织损伤后，愈合功能失调的临床表现，其形成及发展与遗传、感染、解剖部位等诸多因素有关，与之相关的挛缩、畸形、灼热感、瘙痒感、毁容等能够遮掩手术的成功，并成为患者和医生共同关注的问题。目前研究将其发病机制归纳为成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过度产生和沉积。成纤维细胞是创伤愈合时的主要修复细胞，在病理状态下，成纤维细胞增殖旺盛并分泌大量细胞外基质。细胞外基质中含量最多的是I、Ⅲ型胶原，I型胶原较为粗大在皮肤中主要起支持作用，而Ⅲ型胶原包绕着I型胶原起到连接和物质交换等作用，正常瘢痕组织以I型胶原增加为主，在增生性瘢痕中I、Ⅲ型胶原均明显增加。兔耳瘢痕模型制取方便易行，且在增生性瘢痕形成过程中胶原的含量及比例与人增生性瘢痕极为相似，是研究瘢痕中胶原表达变化较为理想的动物模型。目前，增生性瘢痕的治疗方法众多，但都无法达到令人满意的治疗效果，在判定其他治疗方法的疗效时，皮损内类固醇注射治疗被作为标准。
肾素-血管紧张素系统的主要活性成分是血管紧张素Ⅱ，在促进心脏、肾脏、肝脏等器官的纤维化过程中发挥重要作用。皮肤组织具有独立合成血管紧张素Ⅱ的能力；在增生活跃的增生性瘢痕组织中血管紧张素Ⅱ表达增加，并通过血管紧张素Ⅱ的1型受体（ATlR）和2型受体（AT2R）及其下游信号通路来发挥病理生理作用，刺激ATlR可以促进皮肤成纤维细胞增殖及合成I型胶原纤维和转化生长因子B1，刺激AT2R促进皮肤成纤维细胞凋亡，并抑制胶原合成，促进胶原降解。缬沙坦是选择性ATlR受体阻滞剂，通过肝纤维化的研究发现，其可下调Bcl-2表达，抑制肝星状细胞活化；并可下调I型胶原及转化生长因子B1的表达，发挥抗纤维化的作用。与其他ATlR受体阻滞剂相比，缬沙坦几乎不经过代谢，以原形排泄，临床没有发现相关药物在诱导或抑制细胞色素P450系统方面与之发生相互影响。
我们的研究发现，在创伤形成后口服高剂量缬沙坦，对兔耳增生性瘢痕的瘢痕增生指数、成纤维细胞数量、I和Ⅲ型胶原百分比均有较明显抑制作用，说明缬沙坦具有抑制兔耳瘢痕增生的作用。低剂量治疗组的I和Ⅲ型胶原百分比虽有下降，但对大体形态的影响并不显著，表明缬沙坦对兔耳增生性瘢痕的抑制作用可能存在剂量依赖性。关于糖尿病肾病的临床研究表明，双倍剂量的缬沙坦可以显著抑制或逆转间质纤维化、提高疗效、减少复发，而且不良反应无明显增加。以上结果提示我们，应用缬沙坦治疗增生性瘢痕时应使用高剂量，而增加药物剂量后的治疗风险需进一步研究和评估。此外，口服缬沙坦对增生性瘢痕的抑制作用不及皮损内糖皮质激素注射治疗，而且无法使瘢痕完全消退，在治疗增生性瘢痕时仍无法获得理想效果，存在一定局限性。但在糖皮质激素应用禁忌时，可以考虑口服缬沙坦作为替代治疗。
综上所述，高剂量缬沙坦通过抑制成纤维细胞增殖及I和Ⅲ型胶原沉积，可以在一定程度上抑制兔耳瘢痕增生，但是其具体机制、药效剂量关系及联合用药效果有待进一步研究。
[关键词]缬沙坦；曲安奈德；增生性瘢痕；兔耳瘢痕模型
皮肤病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，其形成及发展与遗传、治疗等诸多方面有着密切的联系，但主要的特征为成纤维细胞的过度增生和胶原蛋白代偿失调导致的异常堆积。由于其病因尚不清楚，目前临床上常使用的治疗方法（手术、药物、机械压迫、放射等）都无法完全令人满意。因此，其发病机制及治疗靶点的研究热度经久不衰。肾素一血管紧张素系统在各脏器纤维化过程中发挥重要作用，通过细胞培养研究，人们发现血管紧张素Ⅱ的1型受体（ATlR）拈抗剂氯沙坦能够抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的生长增殖及纤维链接蛋白的合成，提示ATlR拮抗剂可能对增生性瘢痕有防治作用。本研究通过动物实验进一步观察ATlR拮抗剂（缬沙坦）对增生性瘢痕的影响。
1.材料与方法
1.1材料
动物：16只新西兰兔（雌性，2000～2500g，清洁级，分笼饲养），购自广东省医学实验动物中心，饲养于汕头大学医学院实验动物中心，适应性饲养1周后使用。实验设计已通过汕头大学医学院动物实验伦理审查。仪器：Leica DMRXA2全能显微镜（德国Leica公司），Leica RM2235手动转轮切片机（德国Leica公司），CS-VI型摊片、烤片机（孝感市宏业医用仪器有限公司），Leica IM50图像采集系统（德国Leica公司），图像分析系统为Image-ProPlus（Media Cybernetics L.P.），偏振光显微镜（DMR显微镜，Leica）。药物：缬沙坦胶囊（北京诺华制药.有限公司），曲安奈得注射液（上海通用药业股份有限公司）。
1.2方法
使用戊巴比妥钠（1.5mg/kg）静脉麻醉新西兰兔，将兔耳腹侧展平后测量、描绘直径1cm圆形手术区域，每个手术区域间隔约1cm。使用10号手术刀片切开全层皮肤及软骨膜达软骨，蚊式血管钳沿创缘小心剥离全层皮肤及软骨膜。每只兔耳制备6个圆形缺损面，共192处，术后創面暴露，待其自行愈合。
1.3动物分组
按照随机数余数分组法分为4组，每组4只。高剂量治疗组：术后第21天开始予缬沙坦8mg/（kg·d）混悬液（溶剂为灭菌注射用水）灌胃，每天1次；低剂量治疗组：术后第21天开始予缬沙坦4mg/（kg·d）混悬液（溶剂为灭菌注射用水）灌胃，每天1次；阳性对照组：术后第21天和28天分别进行曲安奈德溶液0.1mL皮损内注射；阴性对照组：不给于任何干预。
1.4取材及标本制作
术后第42天，使用戊巴比妥钠（1.5mg/kg）静脉麻醉新西兰兔，切取所有创面标本（直径约1.2cm，圆形），每个标本沿正中线平均分为2份。标本置于10%甲醛溶液中固定、乙醇脱水、石蜡包埋、切片（厚度5um）后，进行HE染色和苦昧酸天狼星红染色。
1.5观察指标
（1）大体观察：术后第42天拍照记录创面情况，观察瘢痕的高度、颜色、质地。镜下观察：胶原纤维的排列、形态。（2）瘢痕增生指数，用测微尺测量兔耳瘢痕最高点至耳软骨表面的垂直厚度（a）、瘢痕周边正常皮肤至耳软骨表面的垂直厚度（b），计算得出瘢痕增生指数（HI=a/b）。（3）成纤维细胞数量：经苏木精一伊红染色制成瘢痕组织切片，按Weidner计数方法在400倍视野光镜下随机计数3个视野的成纤维细胞数量，每个视野由2位医师同时计数，求其平均值。（4）I、Ⅲ型胶原百分比：苦味酸天狼星红染色切片，在100倍偏振光显微镜下每张切片随机计数3个视野，采用Image-ProPlus6.0图像分析系统分别进行检测。I型胶原百分比=（红色区域面积+黄色区域面积）/总面积×100%；Ⅲ型胶原百分比=绿色区域面积/总面积×100%。
1.6统计学分析
采用SPSS16.0统计学软件进行统计分析，数据用（x±s）表示，符合正态分布和方差齐性的数据，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；不符合正态分布或方差齐性的数据，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，P<0.05表示具有统计学差异。
2.结果
2.1大体观察
阳性对照组：瘢痕平坦，颜色最浅，质地最软。高剂量治疗组：瘢痕较平，颜色略红，质地较软。低剂量治疗组和阴性对照组：瘢痕明显隆起，颜色较深，质地坚硬。
2.2镜下观察
阳性对照组：胶原纤维排列整齐，形态纤细。高剂量治疗组：胶原纤维排列欠整齐，形态较纤细。低剂量治疗组：胶原纤维排列紊乱，形态较粗。阴性对照组：胶原纤维排列紊乱，形态粗大。 2.3实验结果
（1）瘢痕增生指数。多组间比较差异有统计学意义。组间两两比较：高剂量治疗组、阳性对照组分别与阴性对照组比较有统计学差异。低剂量治疗组与阴性对照组比较无统计学差异（P=0.15）。（2）成纤维细胞数量。多组间比较差异有统计学意义。组间两两比较：高剂量治疗组、阳性对照组分别与阴性对照组比较有统计学差异。低剂量治疗组与阴性对照组比较无统计学差异（P=0.22）。（3）I型胶原百分比（%）。多组间比较差异有统计学意义。组间两两比较：高剂量治疗组、低剂量治疗组、阳性对照组分别与阴性对照组较有统计学差异。（4）Ⅲ型胶原百分比（%）。多组间比较差异有统计学意义。组间两两比较：高剂量治疗组分别与阳性对照组、阴性对照组比较有统计学差异；高劑量治疗组与低剂量治疗组比较无统计学差异（P=0.50）；低剂量治疗组分别与阳性对照组、阴性对照组比较有统计学差异（P<0.05）。见表1。
3.讨论
增生性瘢痕是由物理、机械、化学、生物等因素引起皮肤组织损伤后，愈合功能失调的临床表现，其形成及发展与遗传、感染、解剖部位等诸多因素有关，与之相关的挛缩、畸形、灼热感、瘙痒感、毁容等能够遮掩手术的成功，并成为患者和医生共同关注的问题。目前研究将其发病机制归纳为成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过度产生和沉积。成纤维细胞是创伤愈合时的主要修复细胞，在病理状态下，成纤维细胞增殖旺盛并分泌大量细胞外基质。细胞外基质中含量最多的是I、Ⅲ型胶原，I型胶原较为粗大在皮肤中主要起支持作用，而Ⅲ型胶原包绕着I型胶原起到连接和物质交换等作用，正常瘢痕组织以I型胶原增加为主，在增生性瘢痕中I、Ⅲ型胶原均明显增加。兔耳瘢痕模型制取方便易行，且在增生性瘢痕形成过程中胶原的含量及比例与人增生性瘢痕极为相似，是研究瘢痕中胶原表达变化较为理想的动物模型。目前，增生性瘢痕的治疗方法众多，但都无法达到令人满意的治疗效果，在判定其他治疗方法的疗效时，皮损内类固醇注射治疗被作为标准。
肾素-血管紧张素系统的主要活性成分是血管紧张素Ⅱ，在促进心脏、肾脏、肝脏等器官的纤维化过程中发挥重要作用。皮肤组织具有独立合成血管紧张素Ⅱ的能力；在增生活跃的增生性瘢痕组织中血管紧张素Ⅱ表达增加，并通过血管紧张素Ⅱ的1型受体（ATlR）和2型受体（AT2R）及其下游信号通路来发挥病理生理作用，刺激ATlR可以促进皮肤成纤维细胞增殖及合成I型胶原纤维和转化生长因子B1，刺激AT2R促进皮肤成纤维细胞凋亡，并抑制胶原合成，促进胶原降解。缬沙坦是选择性ATlR受体阻滞剂，通过肝纤维化的研究发现，其可下调Bcl-2表达，抑制肝星状细胞活化；并可下调I型胶原及转化生长因子B1的表达，发挥抗纤维化的作用。与其他ATlR受体阻滞剂相比，缬沙坦几乎不经过代谢，以原形排泄，临床没有发现相关药物在诱导或抑制细胞色素P450系统方面与之发生相互影响。
我们的研究发现，在创伤形成后口服高剂量缬沙坦，对兔耳增生性瘢痕的瘢痕增生指数、成纤维细胞数量、I和Ⅲ型胶原百分比均有较明显抑制作用，说明缬沙坦具有抑制兔耳瘢痕增生的作用。低剂量治疗组的I和Ⅲ型胶原百分比虽有下降，但对大体形态的影响并不显著，表明缬沙坦对兔耳增生性瘢痕的抑制作用可能存在剂量依赖性。关于糖尿病肾病的临床研究表明，双倍剂量的缬沙坦可以显著抑制或逆转间质纤维化、提高疗效、减少复发，而且不良反应无明显增加。以上结果提示我们，应用缬沙坦治疗增生性瘢痕时应使用高剂量，而增加药物剂量后的治疗风险需进一步研究和评估。此外，口服缬沙坦对增生性瘢痕的抑制作用不及皮损内糖皮质激素注射治疗，而且无法使瘢痕完全消退，在治疗增生性瘢痕时仍无法获得理想效果，存在一定局限性。但在糖皮质激素应用禁忌时，可以考虑口服缬沙坦作为替代治疗。
综上所述，高剂量缬沙坦通过抑制成纤维细胞增殖及I和Ⅲ型胶原沉积，可以在一定程度上抑制兔耳瘢痕增生，但是其具体机制、药效剂量关系及联合用药效果有待进一步研究。