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摘 要 昆虫中肠消化液中含有种类繁杂的蛋白酶，它们在食物消化、免疫反应等方面发挥着复杂且重要的作用。在昆虫生理过程中，蛋白代谢的开始阶段，蛋白酶能水解蛋白质成为多肽，成为中肠水解蛋白酶。类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine proteases，Tryp_SPs）是一类真核生物体中普遍存在的含有胰蛋白酶催化功能域的丝氨酸蛋白酶分子，它行使着很多功能，如食物消化、止血、免疫防卫响应和神经响应等。
关键词 昆虫；中肠蛋白酶；丝氨酸蛋白酶；类胰蛋白酶；进化；分子遗传学
中图分类号：Q966；Q556；Q75 文献标志码：C DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.31.014
知网出版网址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20161124.0941.002.html 網络出版时间：2016-11-24 9：41：00
昆虫中肠消化液中存在的各种酶种类繁杂，起消化食物的作用，其中分解食物中的蛋白质的蛋白酶称为昆虫中肠蛋白酶。目前已知的蛋白酶的分类如下：丝氨酸蛋白酶（Serine proteases）、苏氨酸蛋白酶（Threonine proteases）、半胱氨酸蛋白酶（Cysteine proteases）、天冬氨酸蛋白酶（Aspartic acid proteases）、金属蛋白酶（Metalloproteases）和谷氨酸蛋白酶（Glutamic acid proteases）。昆虫中肠蛋白酶大多数都是一种催化化学键的水解的水解酶。昆虫消化酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶、组织蛋白酶和弹性蛋白酶。中肠的主要蛋白酶是类胰蛋白酶，也是一种丝氨酸蛋白酶。在Heliothis virescens[1]、Mamestra brassicae[2]、Creontiades dilutus[3]、Busseola fusca[4]、Achaea janata[5]、Mosquito[6]和Lutzomyia longipalpis[7] 等昆虫中鉴定出了Tryp_SPs家族。
1 丝氨酸蛋白酶系列结构特点
1.1 丝氨酸蛋白酶的结构特点
在昆虫中肠中，丝氨酸蛋白酶（Serine Proteases，SP）是一种主要的蛋白酶家族，它们作为酶类参与各种生理生化途径过程。丝氨酸蛋白酶的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。其原理是首先通过邻近的氨基酸残基链激活活性中心的丝氨酸残基，被激活的羟基与肽键的碳原子发生亲核反应，从而发生水解反应使得肽键断裂；其次是肽键断裂后，酰基上的碳被酯化，肽键的氮端部分被释放游离。在鳞翅目昆虫中肠中，丝氨酸蛋白酶是一类主要的蛋白酶，它们是中肠蛋白酶主要的活性成员[8]。丝氨酸蛋白酶在结构上为全β蛋白，核心结构由2个非常相似的结构域（N 结构域和C 结构域）构成。由于2个结构域在结构上存在着差异，它们在功能和进化上的作用也就不同。丝氨酸蛋白酶催化中心的3个主要残基中就有2个（Asp 102 & His 57） 位于N端结构域，但是最重要的Ser 195 却在C端结构域上，且其他重要的功能位点都位于C端结构域，其中包括稳定催化中间产物的氧离子孔（Gly 193 & Ser 195），底物特异性口袋（ Ser 189、Gly 216 & Gly 226），主链底物结合位点（Ser 214，Trp 215 & Gly216）。C端结构域还含有2个十分重要的保守二硫键，C端结构域上包含了绝大部分的功能位点，因此C端结构域执行丝氨酸蛋白酶的主要催化功能；而N端结构域的主要功能则可能是同C端结构域配合，从而保证催化中心三联体的结构稳定和功能活性[9]。
1.2 Clip-domain_SPs、Tryp_SPs的结构特点
Clip-domain_SPs是丝氨酸蛋白酶的一种，在氨基酸序列中有一个37～55个的基序（motif），这段序列特点是富含半胱氨酸。6个半胱氨酸保守残基在空间结构中形成一个类似2张纸一样的拓扑结构，因此这类丝氨酸蛋白酶叫做Clip-domain_SPs。类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine proteases，Tryp_SPs）是一类真核生物体中普遍存在的含有胰蛋白酶催化功能域的丝氨酸蛋白酶，它行使很多包括食物消化、止血、免疫防卫响应和神经响应在内的功能。它们拥有一系列肽活性，如外肽酶、内肽酶、低聚肽和Ω-肽活性。基于序列相似性和功能关系把SP归为20个家族（S1～S66），通过进化分析发现其中很多属于无根进化关系。不考虑它们的进化起源，我们发现其中有些肽的分子机制是相似的。胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和羧肽酶C有着相同的活性氨基酸：丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸。在生化反应中，丝氨酸作为亲核基团，天冬氨酸作为亲电基团，组氨酸作为一个基本基团，分别参与到分子过程中去。尽管在分子活性基团有差别，但是从蛋白分子结构相似上来说仍然有着相似性，例如在胰凝乳蛋白酶亚家族中的活性三联体是HDS，在枯草杆菌蛋白酶家族中的活性三聯体是DHS，但在羧肽酶C中活性三联体是SDH。
2 蚊子中的类胰蛋白酶家族的消化研究及其在进化中的作用
2.1 寄主和寄生虫间胰蛋白酶的消化作用
蚊子是传播人类寄生虫病和病毒病的主要媒介，主要传播疟疾、丝虫病、骨痛热病和黄热热病等，这些疾病对人类的健康构成了严重的威胁。阻止病原的传播成为控制疾病的重要手段。当前，人类已经获得冈比亚按蚊、致倦库蚊、埃及伊蚊的基因组数据，通过这些基因组数据制订相应的措施来研究病虫的传播机制是目前一项热门手段。血液是雌蚊完成生殖成熟周期的重要营养成分，它促使雌蚊正常产卵和合成卵黄蛋白。因此，对于血液性寄生害虫的遗传机制的研究有助于控制病虫害的传播。之前的比较基因组学表明这些物种间的相关基因呈现出突出的适应性、动态化和多样化。 丝氨酸蛋白酶在生理过程中扮演着重要的作用：例如对于蛋白前体的活性剪切来激活成活体来行使相应分子功能。类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶是一类真核生物体中普遍存在的含有胰蛋白酶催化功能域的分子，它行使很多包括食物消化、止血、免疫防卫响应和神经响应在内的功能。在蚊子中，2类类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）在食物消化中的生理功能已经被详尽的阐述。冈比亚按蚊基因组中含有7个胰蛋白酶基因，它们聚类地位于染色体3R一个11 kb大小的区域中，其中已知5个基因编码功能蛋白。那么血液寄生虫和寄主间，这类蛋白酶扮演着什么样的功能呢？目前，人们推测：在寄主体内的寄生虫编码几丁质蛋白，寄主的丝氨酸蛋白酶通过激活几丁质蛋白来增强中肠围食膜的通透性，从而使得寄生虫在体内能够运输，进而提高生存率。通过实验表明，给蚊子喂食丝氨酸蛋白酶抑制剂后寄生虫生长滞育显著加强，已经在冈比亚按蚊基因组中发现3个胰凝乳蛋白酶基因。
2.2 蛋白酶的进化研究
2.2.1 遗传中蛋白酶家族大小的变化与进化的关系
人们推测在环境选择压力下基因功能趋于专一化，那么Tryp_SPc家族在基因家族的成员数量的大小和复杂度上也应该体现增大现象。例如，在冈比亚按蚊、黑腹果蝇、人和红鳍河豚鱼的蛋白组研究鉴定出Tryp_SPc家族各305， 206， 110， 125个功能基因。相比较而言，在秀丽隐杆线虫蛋白组中只鉴定出13个Tryp_SPc基因。相对非脊椎动物而言，脊椎动物的Tryp_SPc蛋白结构更加复杂，这些蛋白不仅包括Tryp_SPc的功能域，而且还包括其他的功能域。在功能上，Tryp_SPc家族的大小在各物种起到不同的作用。在非脊椎动物中，丝氨酸蛋白酶在消化、血淋巴凝固、黑色素形成、抗微生物肽合成起到重要作用，同时也能激活寄主快速免疫途径。Tryp_SPc在消化系统中的作用很复杂，扮演着各种各样的角色。
为了解Tryp_SPc的作用（特别是对血液寄生虫的作用），首先要根据物种的基因组序列，通过生物信息学方法鉴定出所有Tryp_SPc成员，并在基因组水平上研究蚊子吸血前和吸血后的蛋白酶的含量变化，进而研究它们的分子复杂性和进化关系。研究发现，成员增多亚家族成员表达量增加更加显著。冈比亚按蚊、埃及伊蚊、致倦库蚊和黑腹果蝇相比较，Tryp_SPc家族成员数量分别增加32.7%、46%、55%。虽然蚊子和果蝇家族成员大小有很大的区别，但是蚊子中间的差别更小，这表明：蚊子种间Tryp_SPc家族成员数量大小和功能从种间分化开始是保守的。进化树表明，在蚊子的种间分化前有很多成员是共有的，并在分化过程中形成了很多特有的成员[6]（Wu，Wang et al. 2009）。以上研究表明，Tryp_SPc基因的增加是蚊子进化中的一种适应机制，并且有可能由获得寄生虫后诱发的机制。
2.2.2 表达水平和在染色体中的分布研究
功能确定的基因趋于复制和拥有更高的进化速率，基因成员数量和表达量的增加和新的生物学功能相关[10]；在动态选择压力下，功能和进化稳定性之间在遗传上密切相关[11-12]。蚊子吸血过后，Tryp_SPc家族成員组成数量上大体增加，基因表达水平也提高了。在冈比亚按蚊中，特有基因在吸血前后，表达量显著上升。在冈比亚按蚊基因组中Tryp_SPc基因在染色体中是串联聚类，串联基因复制在Tryp_SPc的增多上有着重要的作用[6]。
2.2.3 蛋白酶的正向选择及三维结构分析
适应性进化中，有些基因趋向特异基因，从而使得家族成员增多，正向选择是这一机制的主要动力。对于吸血之后诱导特异基因和水平显著增加的基因，计算它们的dN/dS值，得到比值大于1，说明Tryp_SPc在进化过程中是正向选择，进而说明了适应进化使得血液寄生虫能够适应外源血液。
构建三维分子结构发现活性选择性残基在分子结构的表面，并且包括与丝氨酸蛋白酶抑制剂相结合的活性位点，因此认为活性选择位点对于Tryp_SPc与血液的消化起着至关重要的作用。
3 Glossina morsitans中CLIP-domain SPs的研究进展
3.1 CLIP-domain SPs在级联反应中的作用
The CLIP-domain SPs参与到昆虫免疫级联反应[13]。在昆虫受到真菌或者细菌感染过程中，CLIP-domain SP Persephone中的活性部分激活CLIP Spatzle途径中酶（SPE），SPE激活Pro-Spatzle；前提Spatzle结合到Toll受体，然后激发Toll途径；Toll受体结合后激活AMP转录，从而完成级联反应。黑化是另一个昆虫中特有的免疫反应，一系列的CLIP-domain SPs激发酶原为酚的物质，形成黑色素后阻止病原的入侵。
3.2 Glossina morsitans中CLIP-domain SPs的鉴定和进化分析
目前，通过Expressed Sequence Tag（EST）、基因组和蛋白组技术能够快速地鉴定CLIP-domain SPs的基因。在Glossina morsitans中，通过生物信息方法找到CLIP-domain SPs的EST后，同已知物种中的CLIP-domain SPs进行相似性比对和进化分析，找到了在果蝇中存在并且和免疫相关的Persephone、SPE、Snake、Spirit基因；认为它们可能行使这种分子功能，然后参与到Glossina morsitans的免疫过程中[14]。
4 讨论
蛋白酶在很多物种中都普遍存在，起着重要作用。丝氨酸蛋白酶超家族作为蛋白酶，参与到昆虫生理生化中的各种过程中。随着转录组、基因组和蛋白组的快速建立，通过生物信息的方法使我们能够快速有效的获得目标基因，并且研究它们的表达变化。对于已知的基因和蛋白序列进行遗传分析，能使我们明确分子间的进化关系和进化过程中的机理。在昆虫中，Tryp_SPC和CLIP-domain SPs是丝氨酸超家族中的两大类亚家族，它们参与到昆虫的食物消化和免疫反应中，发挥着积极有效的作用。通过对它们分子研究和进化分析，使得我们能进一步明确它们的功能，从而为害虫的防治提供了理论依据，为以后的研究打下了坚实的基础。 参考文献：
[1] Karumbaiah， L.， B. Oppert， Jurat-Fuentes J. L.， et al. Analysis of midgut proteinases from Bacillus thuringiensis-susceptible and -resistant Heliothis virescens（Lepidoptera：Noctuidae） [J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2007， 146（1）：139-146.
[2] Chougule， N. P.， E. Doyle， Fitches E.， et al. Biochemical characterization of midgut digestive proteases from Mamestra brassicae（cabbage moth；Lepidoptera：Noctuidae） and effect of soybean Kunitz inhibitor（SKTI） in feeding assays[J]. J Insect Physiol. 2008， 54（3）：563-572.
[3] Colebatch， G.， P. Cooper， East P.， cDNA cloning of a salivary chymotrypsin-like protease and the identification of six additional cDNAs encoding putative digestive proteases from the green mirid， Creontiades dilutus（Hemiptera：Miridae） [J]. Insect Biochem Mol Biol. 2002， 32（9）：1065-1075.
[4] George， D.， N. Ferry， Back E.J.， et al. Characterisation of midgut digestive proteases from the maize stem borer Busseola fusca[J]. Pest Manag Sci. 2008， 64（11）：1151-1158.
[5] Budatha， M.， G. Meur， Dutta-Gupta A. Identification and characterization of midgut proteases in Achaea janata and their implications[J]. Biotechnol Lett.2008， 30（2）：305-310.
[6] Wu， D. D.， G. D. Wang， Irwin D. M .， et al. A profound role for the expansion of trypsin-like serine protease family in the evolution of hematophagy in mosquito[J]. Mol Biol Evol， 2009， 26（10）：2333-2341.
[7] Telleria， E. L.， A. P. de Araujo， Secundino N. F.， et al. Trypsin-like serine proteases in Lutzomyia longipalpis-expression， activity and possible modulation by Leishmania infantum chagasi[J]. PLoS One， 2010， 5（5）：e10697.
[8] Patankar， A. G.， A. P. Giri， Harsulkar A. M.， et al. Complexity in specificities and expression of Helicoverpa armigera gut proteinases explains polyphagous nature of the insect pest[J]. Insect Biochem Mol Biol， 2001， 31（4-5）：453-464.
[9] 季星來，孙之荣. 基于结构的丝氨酸蛋白酶超家族进化分析[J].电子学报， 2001， 29（12A）：1756-1758.
[10] Lespinet， O.， Y. I. Wolf， Koonin EVet， al. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes[J].Genome Res， 2002， 12（7）：1048-1059.
[11] Thomas， J. H. Adaptive evolution in two large families of ubiquitin-ligase adapters in nematodes and plants[J]. Genome Res， 2006 16（8）：1017-1030.
[12] Thomas， J. H. Rapid birth-death evolution specific to xenobiotic cytochrome P450 genes in vertebrates[J]. PLoS Genet， 2007 3（5）：e67.
[13] Jiang， H. and M. R. Kanost. The clip-domain family of serine proteinases in arthropods[J]. Insect Biochem Mol Biol， 2000， 30（2）：95-105.
[14] Mwangi， S.， E. Murungi， Jonas M.， et al. Evolutionary genomics of Glossina morsitans immune-related CLIP domain serine proteases and serine protease inhibitors[J]. Infect Genet Evol， 2011；11（4）：740-745.
（责任编辑：丁志祥）
关键词 昆虫；中肠蛋白酶；丝氨酸蛋白酶；类胰蛋白酶；进化；分子遗传学
中图分类号：Q966；Q556；Q75 文献标志码：C DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.31.014
知网出版网址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20161124.0941.002.html 網络出版时间：2016-11-24 9：41：00
昆虫中肠消化液中存在的各种酶种类繁杂，起消化食物的作用，其中分解食物中的蛋白质的蛋白酶称为昆虫中肠蛋白酶。目前已知的蛋白酶的分类如下：丝氨酸蛋白酶（Serine proteases）、苏氨酸蛋白酶（Threonine proteases）、半胱氨酸蛋白酶（Cysteine proteases）、天冬氨酸蛋白酶（Aspartic acid proteases）、金属蛋白酶（Metalloproteases）和谷氨酸蛋白酶（Glutamic acid proteases）。昆虫中肠蛋白酶大多数都是一种催化化学键的水解的水解酶。昆虫消化酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶、组织蛋白酶和弹性蛋白酶。中肠的主要蛋白酶是类胰蛋白酶，也是一种丝氨酸蛋白酶。在Heliothis virescens[1]、Mamestra brassicae[2]、Creontiades dilutus[3]、Busseola fusca[4]、Achaea janata[5]、Mosquito[6]和Lutzomyia longipalpis[7] 等昆虫中鉴定出了Tryp_SPs家族。
1 丝氨酸蛋白酶系列结构特点
1.1 丝氨酸蛋白酶的结构特点
在昆虫中肠中，丝氨酸蛋白酶（Serine Proteases，SP）是一种主要的蛋白酶家族，它们作为酶类参与各种生理生化途径过程。丝氨酸蛋白酶的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。其原理是首先通过邻近的氨基酸残基链激活活性中心的丝氨酸残基，被激活的羟基与肽键的碳原子发生亲核反应，从而发生水解反应使得肽键断裂；其次是肽键断裂后，酰基上的碳被酯化，肽键的氮端部分被释放游离。在鳞翅目昆虫中肠中，丝氨酸蛋白酶是一类主要的蛋白酶，它们是中肠蛋白酶主要的活性成员[8]。丝氨酸蛋白酶在结构上为全β蛋白，核心结构由2个非常相似的结构域（N 结构域和C 结构域）构成。由于2个结构域在结构上存在着差异，它们在功能和进化上的作用也就不同。丝氨酸蛋白酶催化中心的3个主要残基中就有2个（Asp 102 & His 57） 位于N端结构域，但是最重要的Ser 195 却在C端结构域上，且其他重要的功能位点都位于C端结构域，其中包括稳定催化中间产物的氧离子孔（Gly 193 & Ser 195），底物特异性口袋（ Ser 189、Gly 216 & Gly 226），主链底物结合位点（Ser 214，Trp 215 & Gly216）。C端结构域还含有2个十分重要的保守二硫键，C端结构域上包含了绝大部分的功能位点，因此C端结构域执行丝氨酸蛋白酶的主要催化功能；而N端结构域的主要功能则可能是同C端结构域配合，从而保证催化中心三联体的结构稳定和功能活性[9]。
1.2 Clip-domain_SPs、Tryp_SPs的结构特点
Clip-domain_SPs是丝氨酸蛋白酶的一种，在氨基酸序列中有一个37～55个的基序（motif），这段序列特点是富含半胱氨酸。6个半胱氨酸保守残基在空间结构中形成一个类似2张纸一样的拓扑结构，因此这类丝氨酸蛋白酶叫做Clip-domain_SPs。类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine proteases，Tryp_SPs）是一类真核生物体中普遍存在的含有胰蛋白酶催化功能域的丝氨酸蛋白酶，它行使很多包括食物消化、止血、免疫防卫响应和神经响应在内的功能。它们拥有一系列肽活性，如外肽酶、内肽酶、低聚肽和Ω-肽活性。基于序列相似性和功能关系把SP归为20个家族（S1～S66），通过进化分析发现其中很多属于无根进化关系。不考虑它们的进化起源，我们发现其中有些肽的分子机制是相似的。胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和羧肽酶C有着相同的活性氨基酸：丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸。在生化反应中，丝氨酸作为亲核基团，天冬氨酸作为亲电基团，组氨酸作为一个基本基团，分别参与到分子过程中去。尽管在分子活性基团有差别，但是从蛋白分子结构相似上来说仍然有着相似性，例如在胰凝乳蛋白酶亚家族中的活性三联体是HDS，在枯草杆菌蛋白酶家族中的活性三聯体是DHS，但在羧肽酶C中活性三联体是SDH。
2 蚊子中的类胰蛋白酶家族的消化研究及其在进化中的作用
2.1 寄主和寄生虫间胰蛋白酶的消化作用
蚊子是传播人类寄生虫病和病毒病的主要媒介，主要传播疟疾、丝虫病、骨痛热病和黄热热病等，这些疾病对人类的健康构成了严重的威胁。阻止病原的传播成为控制疾病的重要手段。当前，人类已经获得冈比亚按蚊、致倦库蚊、埃及伊蚊的基因组数据，通过这些基因组数据制订相应的措施来研究病虫的传播机制是目前一项热门手段。血液是雌蚊完成生殖成熟周期的重要营养成分，它促使雌蚊正常产卵和合成卵黄蛋白。因此，对于血液性寄生害虫的遗传机制的研究有助于控制病虫害的传播。之前的比较基因组学表明这些物种间的相关基因呈现出突出的适应性、动态化和多样化。 丝氨酸蛋白酶在生理过程中扮演着重要的作用：例如对于蛋白前体的活性剪切来激活成活体来行使相应分子功能。类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶是一类真核生物体中普遍存在的含有胰蛋白酶催化功能域的分子，它行使很多包括食物消化、止血、免疫防卫响应和神经响应在内的功能。在蚊子中，2类类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）在食物消化中的生理功能已经被详尽的阐述。冈比亚按蚊基因组中含有7个胰蛋白酶基因，它们聚类地位于染色体3R一个11 kb大小的区域中，其中已知5个基因编码功能蛋白。那么血液寄生虫和寄主间，这类蛋白酶扮演着什么样的功能呢？目前，人们推测：在寄主体内的寄生虫编码几丁质蛋白，寄主的丝氨酸蛋白酶通过激活几丁质蛋白来增强中肠围食膜的通透性，从而使得寄生虫在体内能够运输，进而提高生存率。通过实验表明，给蚊子喂食丝氨酸蛋白酶抑制剂后寄生虫生长滞育显著加强，已经在冈比亚按蚊基因组中发现3个胰凝乳蛋白酶基因。
2.2 蛋白酶的进化研究
2.2.1 遗传中蛋白酶家族大小的变化与进化的关系
人们推测在环境选择压力下基因功能趋于专一化，那么Tryp_SPc家族在基因家族的成员数量的大小和复杂度上也应该体现增大现象。例如，在冈比亚按蚊、黑腹果蝇、人和红鳍河豚鱼的蛋白组研究鉴定出Tryp_SPc家族各305， 206， 110， 125个功能基因。相比较而言，在秀丽隐杆线虫蛋白组中只鉴定出13个Tryp_SPc基因。相对非脊椎动物而言，脊椎动物的Tryp_SPc蛋白结构更加复杂，这些蛋白不仅包括Tryp_SPc的功能域，而且还包括其他的功能域。在功能上，Tryp_SPc家族的大小在各物种起到不同的作用。在非脊椎动物中，丝氨酸蛋白酶在消化、血淋巴凝固、黑色素形成、抗微生物肽合成起到重要作用，同时也能激活寄主快速免疫途径。Tryp_SPc在消化系统中的作用很复杂，扮演着各种各样的角色。
为了解Tryp_SPc的作用（特别是对血液寄生虫的作用），首先要根据物种的基因组序列，通过生物信息学方法鉴定出所有Tryp_SPc成员，并在基因组水平上研究蚊子吸血前和吸血后的蛋白酶的含量变化，进而研究它们的分子复杂性和进化关系。研究发现，成员增多亚家族成员表达量增加更加显著。冈比亚按蚊、埃及伊蚊、致倦库蚊和黑腹果蝇相比较，Tryp_SPc家族成员数量分别增加32.7%、46%、55%。虽然蚊子和果蝇家族成员大小有很大的区别，但是蚊子中间的差别更小，这表明：蚊子种间Tryp_SPc家族成员数量大小和功能从种间分化开始是保守的。进化树表明，在蚊子的种间分化前有很多成员是共有的，并在分化过程中形成了很多特有的成员[6]（Wu，Wang et al. 2009）。以上研究表明，Tryp_SPc基因的增加是蚊子进化中的一种适应机制，并且有可能由获得寄生虫后诱发的机制。
2.2.2 表达水平和在染色体中的分布研究
功能确定的基因趋于复制和拥有更高的进化速率，基因成员数量和表达量的增加和新的生物学功能相关[10]；在动态选择压力下，功能和进化稳定性之间在遗传上密切相关[11-12]。蚊子吸血过后，Tryp_SPc家族成員组成数量上大体增加，基因表达水平也提高了。在冈比亚按蚊中，特有基因在吸血前后，表达量显著上升。在冈比亚按蚊基因组中Tryp_SPc基因在染色体中是串联聚类，串联基因复制在Tryp_SPc的增多上有着重要的作用[6]。
2.2.3 蛋白酶的正向选择及三维结构分析
适应性进化中，有些基因趋向特异基因，从而使得家族成员增多，正向选择是这一机制的主要动力。对于吸血之后诱导特异基因和水平显著增加的基因，计算它们的dN/dS值，得到比值大于1，说明Tryp_SPc在进化过程中是正向选择，进而说明了适应进化使得血液寄生虫能够适应外源血液。
构建三维分子结构发现活性选择性残基在分子结构的表面，并且包括与丝氨酸蛋白酶抑制剂相结合的活性位点，因此认为活性选择位点对于Tryp_SPc与血液的消化起着至关重要的作用。
3 Glossina morsitans中CLIP-domain SPs的研究进展
3.1 CLIP-domain SPs在级联反应中的作用
The CLIP-domain SPs参与到昆虫免疫级联反应[13]。在昆虫受到真菌或者细菌感染过程中，CLIP-domain SP Persephone中的活性部分激活CLIP Spatzle途径中酶（SPE），SPE激活Pro-Spatzle；前提Spatzle结合到Toll受体，然后激发Toll途径；Toll受体结合后激活AMP转录，从而完成级联反应。黑化是另一个昆虫中特有的免疫反应，一系列的CLIP-domain SPs激发酶原为酚的物质，形成黑色素后阻止病原的入侵。
3.2 Glossina morsitans中CLIP-domain SPs的鉴定和进化分析
目前，通过Expressed Sequence Tag（EST）、基因组和蛋白组技术能够快速地鉴定CLIP-domain SPs的基因。在Glossina morsitans中，通过生物信息方法找到CLIP-domain SPs的EST后，同已知物种中的CLIP-domain SPs进行相似性比对和进化分析，找到了在果蝇中存在并且和免疫相关的Persephone、SPE、Snake、Spirit基因；认为它们可能行使这种分子功能，然后参与到Glossina morsitans的免疫过程中[14]。
4 讨论
蛋白酶在很多物种中都普遍存在，起着重要作用。丝氨酸蛋白酶超家族作为蛋白酶，参与到昆虫生理生化中的各种过程中。随着转录组、基因组和蛋白组的快速建立，通过生物信息的方法使我们能够快速有效的获得目标基因，并且研究它们的表达变化。对于已知的基因和蛋白序列进行遗传分析，能使我们明确分子间的进化关系和进化过程中的机理。在昆虫中，Tryp_SPC和CLIP-domain SPs是丝氨酸超家族中的两大类亚家族，它们参与到昆虫的食物消化和免疫反应中，发挥着积极有效的作用。通过对它们分子研究和进化分析，使得我们能进一步明确它们的功能，从而为害虫的防治提供了理论依据，为以后的研究打下了坚实的基础。 参考文献：
[1] Karumbaiah， L.， B. Oppert， Jurat-Fuentes J. L.， et al. Analysis of midgut proteinases from Bacillus thuringiensis-susceptible and -resistant Heliothis virescens（Lepidoptera：Noctuidae） [J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2007， 146（1）：139-146.
[2] Chougule， N. P.， E. Doyle， Fitches E.， et al. Biochemical characterization of midgut digestive proteases from Mamestra brassicae（cabbage moth；Lepidoptera：Noctuidae） and effect of soybean Kunitz inhibitor（SKTI） in feeding assays[J]. J Insect Physiol. 2008， 54（3）：563-572.
[3] Colebatch， G.， P. Cooper， East P.， cDNA cloning of a salivary chymotrypsin-like protease and the identification of six additional cDNAs encoding putative digestive proteases from the green mirid， Creontiades dilutus（Hemiptera：Miridae） [J]. Insect Biochem Mol Biol. 2002， 32（9）：1065-1075.
[4] George， D.， N. Ferry， Back E.J.， et al. Characterisation of midgut digestive proteases from the maize stem borer Busseola fusca[J]. Pest Manag Sci. 2008， 64（11）：1151-1158.
[5] Budatha， M.， G. Meur， Dutta-Gupta A. Identification and characterization of midgut proteases in Achaea janata and their implications[J]. Biotechnol Lett.2008， 30（2）：305-310.
[6] Wu， D. D.， G. D. Wang， Irwin D. M .， et al. A profound role for the expansion of trypsin-like serine protease family in the evolution of hematophagy in mosquito[J]. Mol Biol Evol， 2009， 26（10）：2333-2341.
[7] Telleria， E. L.， A. P. de Araujo， Secundino N. F.， et al. Trypsin-like serine proteases in Lutzomyia longipalpis-expression， activity and possible modulation by Leishmania infantum chagasi[J]. PLoS One， 2010， 5（5）：e10697.
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（责任编辑：丁志祥）