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摘要:文章对毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-PfCP2.9表达的重组疟疾疫苗PfCP2.9的纯化工艺进行了研究。研究表明,分泌在发酵上清液中的目的蛋白,先后经Phenyl疏水层析,超滤更换缓冲液,Q强阴离子交换层析,SP强阳离子交换层系和Superdex75凝胶过滤层析,获得纯度大于98%的目的蛋白,蛋白得率为50%,Wetern-blot分析其具有免疫原性,能够满足后续临床试验用药的要求,为疫苗的产业化铺平了道路。
关键词:重组疟疾疫苗;毕赤酵母;蛋白纯化;疫苗产业化
中图分类号:R382文献标识码:A文章编号:1009-2374 (2010)13-0047-03
疟疾是人类最古老的传染病之一,至今仍在全球肆虐。目前约40%的世界人口仍处在疟疾威胁之中,每年有3～5亿人感染疟疾,其中约100~300万人死亡,大多数为儿童和孕妇。现在研究者普遍认为,研制安全、价廉和有效的疟疾疫苗是人类控制乃至根除疟疾的重要途径。在众多的疟疾候选抗原中,高度保守的裂殖子表面蛋白1(MerozoiteSurfaceProteinl,MSP-l)C末端19kD片段(MSP1-19)和裂殖子顶端膜抗原l(ApicalMembraneAntigenl,AMA-1)是目前两个最有希望的红内期亚单位疫苗。上海第二军医大学病原微生物教研室己经成功构建了由MSP1-19和AMA-1的Ⅲ亚区〔AMA-1(Ⅲ)〕通过接点序列连接而成的融合蛋白,定名为PfCP-2.9,并在毕赤酵母中得到了高水平表达。本文主要研究了毕赤酵母表达的融合抗原PfCP-2.9的纯化工艺,实现了融合抗原的大规模制备,为疫苗的产业化铺平了道路。
一、材料与方法
(一)材料
1.试剂PhenylSepharoseF.F.填料、QSepharoseF.F.填料、SPSepharoseF.F.填料、Superdex75pg60/600预装柱均为GE公司产品;硫酸铵为Amersco公司进口分装;0.45/0.22μm滤膜为Sartorius公司产品;单抗5.2、RabbitantiPfCSP190,第二军医大学病原微生物教研室提供;羊抗兔IgG一AP标记,华美生物工程公司;其它试剂均为国产分析纯。
2.仪器上海离心机研究所高速冷冻连续流离心机;AKTAPurifier,UVis920检测器,各规格层析柱均为GE公司产品;Waterson520R蠕动泵,美国Bio-rad电泳系统,Sartorius公司MWCO10KD超滤系统。
(二)方法
1.PhenylSepharoseF.F.疏水层析发酵液14000rpm离心,取上清过0.45/0.22μm滤膜;加入2mol/L(NH4)2SO4至终浓度为1.2mol/L并调节pH值至6.5,静置30min后,过0.45/0.22μm滤膜;上经A液 (20mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠+1.2mol/L硫酸铵,pH6.5)平衡好的柱子后,用A液淋洗至无蛋白流出,用B液(20mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠+0.3mol/L硫酸铵,pH6.5)洗脱并收集洗脱峰;接着用注射用水洗脱柱床并收集洗脱峰。分别取样,测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
2.疏水层析收集液的超滤脱盐将上一步骤中蛋白收集液超滤,超滤膜截留分子量为10KD,超滤至5000m时,以滤出液相同的速度泵入C液(15mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠,pH6.5),并不停搅拌超滤液,直至超滤液的pH、电导和C液一致。对超滤液和滤过液分别取样,测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
3.QSepharoseF.F.阴离子交换层析将上步中的超滤液,上经D液(20mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠,pH6.5)平衡好的柱子,后用D液淋洗至无蛋白流出,收集上样流出液和淋洗流出液并合并。取样测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
4.SPSepharoseF.F.阳离子交换层析将上步中的收集液调节pH值至4.8后,上经E液(10mmol/L柠檬酸/柠檬酸钠,pH4.8)平衡好的柱子,用E液淋洗至无蛋白流出后,分别用F液(10mmol/L柠檬酸/柠檬酸钠+80mmol/L氯化钠,pH4.8)和G液(10mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠+0.4mol/L氯化钠,pH6.5)洗脱,收集各峰。并分别取样测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
5.Superdex75凝胶过滤层析将上步中收集的G液洗脱收集液60ml上经H液(20mmol/L柠檬酸/柠檬酸三钠+0.15mol/L氯化钠,,pH6.0)平衡好的Superdex7560/600预装柱,再用H液平衡洗脱蛋白,收集各峰。取样测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
6.Westernblot分析凝胶过滤样品经SDS-PAGE,电转移蛋白至硝酸纤维素膜,用3%脱脂奶粉室温封闭30min。弃封闭液,PBST(10mmol/L磷酸盐缓冲液+0.15mol/L氯化钠+0.05%吐温-20,pH7.5)洗膜3次后,加入一抗(mAb5.2,1∶200稀释)室温反应1～2h。弃一抗,PBST洗膜3次后,加入第二抗体(羊抗鼠IgG一AP二抗标记,1∶100稀释)室温反应l～2h。弃二抗,用PBST洗涤3次,加入显色液显色。
二、结果
1.Phenyl Sepharose F.F.疏水层析。发酵液预处理后,经Phenyl疏水层析,目的蛋白被快速地捕获和浓缩,SDS-PAGE图谱如图1所示。由图2可知,目的蛋白主要集中在B液洗脱峰中,大量的色素和分子量较高的杂蛋白集中在WFI(注射用水)的再生洗脱峰中。
Lane1:Proteinmolecularweightstandard;
Lane2:Fermentationsupermatant;
Lane3-4:Clarifiedsupermatant;Lane5:Flowtjrough;
Lane6:ElutionbybufferA;
Lane7:ElutionbybufferB;Lane8:ElutionbyWFI;
Fig.1SDS-PAGE of samples by Pheny1 Sepharose F.F. chromatography
2.疏水层析收集液的超滤脱盐发酵液经疏水层析后,收集液中含有大量的盐离子,不利于下一步的离子交换层析,因此采用超滤的方法对疏水层析收集液进行超滤脱盐,结果见表1。由表1可知,超滤能够有效去除疏水收集液中的盐分,使得电导降低到1.92mS/cm,并且大量的色素能够透过超滤膜,进一步降低了杂质的含量,非常有利于下一步的阴离子交换层析的操作。
3.QSepharoseF.F.阴离子交换层析超滤脱盐样品上QSepharoseF.F.阴离子交换层析柱,收集上样流出液,用缓冲液D平衡至无蛋白流出并收集平衡液,然后再清洗、再生柱
Lane1:Proteinmolecularweightstandard;Lane2:Flowthrough;
Lane3-4:ElutionbywashingbufferD;
Lane5:Elutionby0.5NNaOH.
Fig.2SDS-PAGE of samples by Q chrotagraphy
床,SDS-PAGE分析结果如图2所示。由图2可知,目的蛋白几乎不能结合在层析填料上全部流穿,而绝大部分的杂蛋白和色素则结合在填料上,从而起到了很好的分离效果。此步骤为整个纯化过程的关键。
4.SPSepharoseF.F.阳离子交换层析。用SPSepharoseF.F.
阳离子交换层析对3中组分2～4进行纯化浓缩,SDS-PAGE分析结果见图3。由图3可知,在阳离子交换层析中,缓冲液F可将分子量与目的蛋白非常接近的杂蛋白去除,目的蛋白被浓缩且纯度有了进一步的提高了,但尚有分子量较小的杂蛋白(降解片段)需要进一步的分离。
Lane1:Proteinmolecularweightstandard;
Lane2-3:ElutionbybufferF;
Lane4-5:ElutionbybufferG;
Fig.3SDS-PAGE of samples by SP chromatography
5.Superdex75凝胶过滤层析。用Superdex75pg60/600预装柱对4中的组分5进行精细分离,上样量为60mL,分步收集各组分并进行SDS-PAGE分析,结果见图4。目的蛋白得到了精细纯化,纯度可达98%以上。
Lane1:Proteinmolecularweightstandard;
Lane2-6:Fractionsinmajorelutionpeakinonerun.
Fig.4SDS-PAGE of samples by Gel chromatography
6.Westernblot分析。纯化后的目的蛋白产品经Westernblot分析,见图5。表明纯化的蛋白具有免疫原性。
Fig.5Western-blot analysis of PfCP2.9 bulk
7.纯化结果分析。纯化结果报告见表2。
Table 2Purification Results
三、讨论
目前毕赤酵母表达体系由于其表达产量高,产物可分泌到培养液中而便于纯化,能对表达产物进行正确加工修饰等优点而日益受到人们重视,已有越来越多的药用蛋白通过该表达系统进行表达和纯化,但是也存在着表达产物易被酵母蛋白酶降解的问题。毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-PfCP2.9表达的重组疟疾疫苗PfCP2.9在发酵的后期以及纯化过程中存在着降解现象,因此,在纯化过程中去除蛋白酶的影响是整个纯化工作的前提。笔者曾经将发酵液直接用进行超滤脱盐,但随着超滤的进行,目的蛋白的降解逐渐加重,最后基本上全部降解。在超滤前增加疏水层析的步骤,很好地避免了目的蛋白的降解,推测是第一步的疏水层析不仅捕获浓缩了目的蛋白,而且有效地去除了蛋白酶。我们正以此为起点,开展关于毕赤酵母表达的蛋白酶的研究工作。
笔者所报道的重组疟疾疫苗的纯化工艺,已经放大到处理150L发酵液的规模,重复性极好,达到了产业化生产的要求,为重组疟疾疫苗的产业化铺平了道路。
参考文献
[1]WHO Expert Committeeon Malaria.World Health Organ Tech RepSer,2000,892(i-v).
[2]Pan Weiqing,Daqing Hunag,QingefengZhang,et al.Fusion of two malaria Vaccine candidates enhances product
yield,immunogenieity and antibody-mediated inhibition of parasite growth in vitor[J].Journal of Immunology,2005,(4).
[3]张青峰,潘卫庆.恶性疟原虫融合抗原的改建及其抗体活性的测定[J].生物物理和生物化学学报,2003,35(4).
[4]张树军,杨磊,黄瑾.巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展[J].农垦医学,2007,29(3).
[5]吴腾捷,徐帆洪,孙九如,等.甲醇酵母分泌表达重组人干扰素纯化工艺的建立[J].微生物学免疫学进展,2004,32(2).
[6]黄岩山,董勇,李辉.毕赤酵母表达重组人白细胞介素11的纯化与鉴定[J].生物工程学报,2001,17(3).
[7]孙纯义,李元,李别虎,等.在毕赤酵母菌中表达的hGlp-1-白蛋白融合蛋白的纯化[J].大连民族学院报,2007,9(5).
[8]Sreekrishna K.et al.Strategies for optimal synthesis and
secretion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Gene.1997,190(1).
作者简介:陈佩新 (1975-),男,山东德州人,供职于上海万兴生物制药有限公司开发部,上海交通大学生物工程在读硕士研究生,研究方向:重组蛋白类药物的发酵、纯化工艺。
关键词:重组疟疾疫苗;毕赤酵母;蛋白纯化;疫苗产业化
中图分类号:R382文献标识码:A文章编号:1009-2374 (2010)13-0047-03
疟疾是人类最古老的传染病之一,至今仍在全球肆虐。目前约40%的世界人口仍处在疟疾威胁之中,每年有3～5亿人感染疟疾,其中约100~300万人死亡,大多数为儿童和孕妇。现在研究者普遍认为,研制安全、价廉和有效的疟疾疫苗是人类控制乃至根除疟疾的重要途径。在众多的疟疾候选抗原中,高度保守的裂殖子表面蛋白1(MerozoiteSurfaceProteinl,MSP-l)C末端19kD片段(MSP1-19)和裂殖子顶端膜抗原l(ApicalMembraneAntigenl,AMA-1)是目前两个最有希望的红内期亚单位疫苗。上海第二军医大学病原微生物教研室己经成功构建了由MSP1-19和AMA-1的Ⅲ亚区〔AMA-1(Ⅲ)〕通过接点序列连接而成的融合蛋白,定名为PfCP-2.9,并在毕赤酵母中得到了高水平表达。本文主要研究了毕赤酵母表达的融合抗原PfCP-2.9的纯化工艺,实现了融合抗原的大规模制备,为疫苗的产业化铺平了道路。
一、材料与方法
(一)材料
1.试剂PhenylSepharoseF.F.填料、QSepharoseF.F.填料、SPSepharoseF.F.填料、Superdex75pg60/600预装柱均为GE公司产品;硫酸铵为Amersco公司进口分装;0.45/0.22μm滤膜为Sartorius公司产品;单抗5.2、RabbitantiPfCSP190,第二军医大学病原微生物教研室提供;羊抗兔IgG一AP标记,华美生物工程公司;其它试剂均为国产分析纯。
2.仪器上海离心机研究所高速冷冻连续流离心机;AKTAPurifier,UVis920检测器,各规格层析柱均为GE公司产品;Waterson520R蠕动泵,美国Bio-rad电泳系统,Sartorius公司MWCO10KD超滤系统。
(二)方法
1.PhenylSepharoseF.F.疏水层析发酵液14000rpm离心,取上清过0.45/0.22μm滤膜;加入2mol/L(NH4)2SO4至终浓度为1.2mol/L并调节pH值至6.5,静置30min后,过0.45/0.22μm滤膜;上经A液 (20mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠+1.2mol/L硫酸铵,pH6.5)平衡好的柱子后,用A液淋洗至无蛋白流出,用B液(20mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠+0.3mol/L硫酸铵,pH6.5)洗脱并收集洗脱峰;接着用注射用水洗脱柱床并收集洗脱峰。分别取样,测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
2.疏水层析收集液的超滤脱盐将上一步骤中蛋白收集液超滤,超滤膜截留分子量为10KD,超滤至5000m时,以滤出液相同的速度泵入C液(15mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠,pH6.5),并不停搅拌超滤液,直至超滤液的pH、电导和C液一致。对超滤液和滤过液分别取样,测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
3.QSepharoseF.F.阴离子交换层析将上步中的超滤液,上经D液(20mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠,pH6.5)平衡好的柱子,后用D液淋洗至无蛋白流出,收集上样流出液和淋洗流出液并合并。取样测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
4.SPSepharoseF.F.阳离子交换层析将上步中的收集液调节pH值至4.8后,上经E液(10mmol/L柠檬酸/柠檬酸钠,pH4.8)平衡好的柱子,用E液淋洗至无蛋白流出后,分别用F液(10mmol/L柠檬酸/柠檬酸钠+80mmol/L氯化钠,pH4.8)和G液(10mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠+0.4mol/L氯化钠,pH6.5)洗脱,收集各峰。并分别取样测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
5.Superdex75凝胶过滤层析将上步中收集的G液洗脱收集液60ml上经H液(20mmol/L柠檬酸/柠檬酸三钠+0.15mol/L氯化钠,,pH6.0)平衡好的Superdex7560/600预装柱,再用H液平衡洗脱蛋白,收集各峰。取样测定蛋白含量,进行SDS-PAGE分析。
6.Westernblot分析凝胶过滤样品经SDS-PAGE,电转移蛋白至硝酸纤维素膜,用3%脱脂奶粉室温封闭30min。弃封闭液,PBST(10mmol/L磷酸盐缓冲液+0.15mol/L氯化钠+0.05%吐温-20,pH7.5)洗膜3次后,加入一抗(mAb5.2,1∶200稀释)室温反应1～2h。弃一抗,PBST洗膜3次后,加入第二抗体(羊抗鼠IgG一AP二抗标记,1∶100稀释)室温反应l～2h。弃二抗,用PBST洗涤3次,加入显色液显色。
二、结果
1.Phenyl Sepharose F.F.疏水层析。发酵液预处理后,经Phenyl疏水层析,目的蛋白被快速地捕获和浓缩,SDS-PAGE图谱如图1所示。由图2可知,目的蛋白主要集中在B液洗脱峰中,大量的色素和分子量较高的杂蛋白集中在WFI(注射用水)的再生洗脱峰中。
Lane1:Proteinmolecularweightstandard;
Lane2:Fermentationsupermatant;
Lane3-4:Clarifiedsupermatant;Lane5:Flowtjrough;
Lane6:ElutionbybufferA;
Lane7:ElutionbybufferB;Lane8:ElutionbyWFI;
Fig.1SDS-PAGE of samples by Pheny1 Sepharose F.F. chromatography
2.疏水层析收集液的超滤脱盐发酵液经疏水层析后,收集液中含有大量的盐离子,不利于下一步的离子交换层析,因此采用超滤的方法对疏水层析收集液进行超滤脱盐,结果见表1。由表1可知,超滤能够有效去除疏水收集液中的盐分,使得电导降低到1.92mS/cm,并且大量的色素能够透过超滤膜,进一步降低了杂质的含量,非常有利于下一步的阴离子交换层析的操作。
3.QSepharoseF.F.阴离子交换层析超滤脱盐样品上QSepharoseF.F.阴离子交换层析柱,收集上样流出液,用缓冲液D平衡至无蛋白流出并收集平衡液,然后再清洗、再生柱
Lane1:Proteinmolecularweightstandard;Lane2:Flowthrough;
Lane3-4:ElutionbywashingbufferD;
Lane5:Elutionby0.5NNaOH.
Fig.2SDS-PAGE of samples by Q chrotagraphy
床,SDS-PAGE分析结果如图2所示。由图2可知,目的蛋白几乎不能结合在层析填料上全部流穿,而绝大部分的杂蛋白和色素则结合在填料上,从而起到了很好的分离效果。此步骤为整个纯化过程的关键。
4.SPSepharoseF.F.阳离子交换层析。用SPSepharoseF.F.
阳离子交换层析对3中组分2～4进行纯化浓缩,SDS-PAGE分析结果见图3。由图3可知,在阳离子交换层析中,缓冲液F可将分子量与目的蛋白非常接近的杂蛋白去除,目的蛋白被浓缩且纯度有了进一步的提高了,但尚有分子量较小的杂蛋白(降解片段)需要进一步的分离。
Lane1:Proteinmolecularweightstandard;
Lane2-3:ElutionbybufferF;
Lane4-5:ElutionbybufferG;
Fig.3SDS-PAGE of samples by SP chromatography
5.Superdex75凝胶过滤层析。用Superdex75pg60/600预装柱对4中的组分5进行精细分离,上样量为60mL,分步收集各组分并进行SDS-PAGE分析,结果见图4。目的蛋白得到了精细纯化,纯度可达98%以上。
Lane1:Proteinmolecularweightstandard;
Lane2-6:Fractionsinmajorelutionpeakinonerun.
Fig.4SDS-PAGE of samples by Gel chromatography
6.Westernblot分析。纯化后的目的蛋白产品经Westernblot分析,见图5。表明纯化的蛋白具有免疫原性。
Fig.5Western-blot analysis of PfCP2.9 bulk
7.纯化结果分析。纯化结果报告见表2。
Table 2Purification Results
三、讨论
目前毕赤酵母表达体系由于其表达产量高,产物可分泌到培养液中而便于纯化,能对表达产物进行正确加工修饰等优点而日益受到人们重视,已有越来越多的药用蛋白通过该表达系统进行表达和纯化,但是也存在着表达产物易被酵母蛋白酶降解的问题。毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-PfCP2.9表达的重组疟疾疫苗PfCP2.9在发酵的后期以及纯化过程中存在着降解现象,因此,在纯化过程中去除蛋白酶的影响是整个纯化工作的前提。笔者曾经将发酵液直接用进行超滤脱盐,但随着超滤的进行,目的蛋白的降解逐渐加重,最后基本上全部降解。在超滤前增加疏水层析的步骤,很好地避免了目的蛋白的降解,推测是第一步的疏水层析不仅捕获浓缩了目的蛋白,而且有效地去除了蛋白酶。我们正以此为起点,开展关于毕赤酵母表达的蛋白酶的研究工作。
笔者所报道的重组疟疾疫苗的纯化工艺,已经放大到处理150L发酵液的规模,重复性极好,达到了产业化生产的要求,为重组疟疾疫苗的产业化铺平了道路。
参考文献
[1]WHO Expert Committeeon Malaria.World Health Organ Tech RepSer,2000,892(i-v).
[2]Pan Weiqing,Daqing Hunag,QingefengZhang,et al.Fusion of two malaria Vaccine candidates enhances product
yield,immunogenieity and antibody-mediated inhibition of parasite growth in vitor[J].Journal of Immunology,2005,(4).
[3]张青峰,潘卫庆.恶性疟原虫融合抗原的改建及其抗体活性的测定[J].生物物理和生物化学学报,2003,35(4).
[4]张树军,杨磊,黄瑾.巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展[J].农垦医学,2007,29(3).
[5]吴腾捷,徐帆洪,孙九如,等.甲醇酵母分泌表达重组人干扰素纯化工艺的建立[J].微生物学免疫学进展,2004,32(2).
[6]黄岩山,董勇,李辉.毕赤酵母表达重组人白细胞介素11的纯化与鉴定[J].生物工程学报,2001,17(3).
[7]孙纯义,李元,李别虎,等.在毕赤酵母菌中表达的hGlp-1-白蛋白融合蛋白的纯化[J].大连民族学院报,2007,9(5).
[8]Sreekrishna K.et al.Strategies for optimal synthesis and
secretion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Gene.1997,190(1).
作者简介:陈佩新 (1975-),男,山东德州人,供职于上海万兴生物制药有限公司开发部,上海交通大学生物工程在读硕士研究生,研究方向:重组蛋白类药物的发酵、纯化工艺。