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[摘 要] 目的：建立高效液相法测定土霉素含量的方法。方法：采用Agilent-C18 （4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；流动相：醋酸铵溶液-乙腈（85∶15）；检测波长：280nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。结果：土霉素在0.12-9.6μg范围内线性关系良好，r=0.9999，平均回收率为99.2%，RSD=0.6%（n=6）。结论：该方法简便、准确、灵敏度高、重现性好，适用土霉素片的质量控制。
[关键词] 高效液相色谱法；土霉素；含量测定
[中图分类号]R927.2 [文献标志码] A [文章编号]1007-8517（2015）06-0010-02
土霉素是多环并四苯酸基酰胺母核的衍生物，为一种广谱抗菌素，临床上主要用于革兰阳性菌、阴性菌感染，以及立克次体病、衣原体病、支原体病、螺旋体病的治疗。目前土霉素片的含量测定方法为中国药典规定的抗生素微生物检定法，收载于卫生部药品标准·抗生素分册（第一册）。该方法检验周期长、操作繁琐、影响因素多、易造成误差，且不能满足批量生产质量控制的需要。笔者采用高效液相色谱法取代效价法测定土霉素片的含量，其检验周期短、结果准确、重现性好、稳定性好，现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器 UV-2401PC紫外分光光度计（日本岛津）；LC-2010AHT高效液相色谱仪（日本岛津）；梅特勒AG-135型电子天平；梅特勒TOLEDO型酸度计（精度：0.01pH单位）； KQ-5200E型超声波清洗器。
1.2 材料 土霉素对照品（批号：130487-200302，含量：88.2%，中国药品生物制品检定所）；土霉素片（批号：140113、140118、140105，规格：0.25g）；所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：AgilentTM-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；流动相：醋酸铵溶液[0.25mol/L醋酸铵溶液-0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺（100∶10∶1），用醋酸调节pH值至7.5]-乙腈（85∶15）；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：280nm；进样量：10μl。理论塔板数按四环素峰计算应不低于3000，四环素峰与相邻杂质峰的分离度应符合中国药典2010年版二部附录VD规定（不低于1.5）。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定土霉素对照品30.31mg，置于50ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液稀至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取土霉素片10片，精密称定，平均片重0.3578g，研细，精密称取0.3647g（约相当于土霉素0.25g），置于500ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
2.3 色谱测定 分别精密量取对照品溶液（约0.1mg/ml）和供试品溶液（约0.1mg/ml）各10μl ，注入液相色谱仪测定，即得。见图1、2。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 精密量取土霉素对照品溶液（0.1mg/ml）10μl，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，RSD为0.1%，说明精密度良好。
2.4.2 线性关系考察 取上述土霉素对照品溶液（0.1mg/ml），分别精取 1、3、5、10、20、40、60、80μl，注入液相色谱仪（自动进样），记录峰面积。以进样量对峰面积进行回归，得回归方程：Y=213450X-89963，r=0.9999。
2.4.3 稳定性试验 取同一批号样品（批号：140118），分别于0、3、5、7、10、12、15、20、24、30h测定，结果RSD为0.3%，表明样品在30h内稳定。
2.4.4 重现性试验 取同一批号样品（批号：140118），依供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，分别测定峰面积，计算土霉素含量。结果测得平均含量为95.7%，RSD为0.12%（n=6），表明该法重现性良好。
2.4.5 加样回收试验 精密稱取已知含量（670.34mg/g）的样品6份，配置成所需浓度，和标准品溶液（0.53447mg/ml），各5ml，置于50ml量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。平均回收率99.2%，RSD=0.6%。结果见表1。
2.4.6 样品的含量测定 取三批样品，依法制备供试品溶液，精密吸取10μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，按外标法计算含量，结果批号为140113、140118、140105的土霉素样品结果为95.6%、95.9%、95.5%。按微生物检定法测定三批样品结果为95.1%、95.2%、95.0%。
3 讨论
在实验中如果遇到土霉素主峰与相邻杂质峰分离效果不能满足实验要求，可以减少乙腈的比例，改变流动相的极性，使土霉素主峰的保留时间延长，达到其与杂质峰分离的目的，具体改变多少，依据实验条件反复摸索而定。
由试验结果可知，该方法简单、快捷、重现性好、灵敏度高，测定结果与微生物检定法相吻合，并可批量检测，可用于土霉素含量的质量控制。
参考文献
[1] WS1-C2-0007-89，四环素片[S].中华人民共和国卫生部药品标准.抗生素药品（第一册），1989.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：635-636.
[关键词] 高效液相色谱法；土霉素；含量测定
[中图分类号]R927.2 [文献标志码] A [文章编号]1007-8517（2015）06-0010-02
土霉素是多环并四苯酸基酰胺母核的衍生物，为一种广谱抗菌素，临床上主要用于革兰阳性菌、阴性菌感染，以及立克次体病、衣原体病、支原体病、螺旋体病的治疗。目前土霉素片的含量测定方法为中国药典规定的抗生素微生物检定法，收载于卫生部药品标准·抗生素分册（第一册）。该方法检验周期长、操作繁琐、影响因素多、易造成误差，且不能满足批量生产质量控制的需要。笔者采用高效液相色谱法取代效价法测定土霉素片的含量，其检验周期短、结果准确、重现性好、稳定性好，现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器 UV-2401PC紫外分光光度计（日本岛津）；LC-2010AHT高效液相色谱仪（日本岛津）；梅特勒AG-135型电子天平；梅特勒TOLEDO型酸度计（精度：0.01pH单位）； KQ-5200E型超声波清洗器。
1.2 材料 土霉素对照品（批号：130487-200302，含量：88.2%，中国药品生物制品检定所）；土霉素片（批号：140113、140118、140105，规格：0.25g）；所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：AgilentTM-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；流动相：醋酸铵溶液[0.25mol/L醋酸铵溶液-0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺（100∶10∶1），用醋酸调节pH值至7.5]-乙腈（85∶15）；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：280nm；进样量：10μl。理论塔板数按四环素峰计算应不低于3000，四环素峰与相邻杂质峰的分离度应符合中国药典2010年版二部附录VD规定（不低于1.5）。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定土霉素对照品30.31mg，置于50ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液稀至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取土霉素片10片，精密称定，平均片重0.3578g，研细，精密称取0.3647g（约相当于土霉素0.25g），置于500ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5ml，置于25ml容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
2.3 色谱测定 分别精密量取对照品溶液（约0.1mg/ml）和供试品溶液（约0.1mg/ml）各10μl ，注入液相色谱仪测定，即得。见图1、2。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 精密量取土霉素对照品溶液（0.1mg/ml）10μl，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，RSD为0.1%，说明精密度良好。
2.4.2 线性关系考察 取上述土霉素对照品溶液（0.1mg/ml），分别精取 1、3、5、10、20、40、60、80μl，注入液相色谱仪（自动进样），记录峰面积。以进样量对峰面积进行回归，得回归方程：Y=213450X-89963，r=0.9999。
2.4.3 稳定性试验 取同一批号样品（批号：140118），分别于0、3、5、7、10、12、15、20、24、30h测定，结果RSD为0.3%，表明样品在30h内稳定。
2.4.4 重现性试验 取同一批号样品（批号：140118），依供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，分别测定峰面积，计算土霉素含量。结果测得平均含量为95.7%，RSD为0.12%（n=6），表明该法重现性良好。
2.4.5 加样回收试验 精密稱取已知含量（670.34mg/g）的样品6份，配置成所需浓度，和标准品溶液（0.53447mg/ml），各5ml，置于50ml量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。平均回收率99.2%，RSD=0.6%。结果见表1。
2.4.6 样品的含量测定 取三批样品，依法制备供试品溶液，精密吸取10μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，按外标法计算含量，结果批号为140113、140118、140105的土霉素样品结果为95.6%、95.9%、95.5%。按微生物检定法测定三批样品结果为95.1%、95.2%、95.0%。
3 讨论
在实验中如果遇到土霉素主峰与相邻杂质峰分离效果不能满足实验要求，可以减少乙腈的比例，改变流动相的极性，使土霉素主峰的保留时间延长，达到其与杂质峰分离的目的，具体改变多少，依据实验条件反复摸索而定。
由试验结果可知，该方法简单、快捷、重现性好、灵敏度高，测定结果与微生物检定法相吻合，并可批量检测，可用于土霉素含量的质量控制。
参考文献
[1] WS1-C2-0007-89，四环素片[S].中华人民共和国卫生部药品标准.抗生素药品（第一册），1989.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：635-636.