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摘要[目的]验证花药特异性启动子LAT52能否在甘蓝花药中发挥功能。[方法]从番茄中扩增得到LAT52核心序列608 bp，进行序列分析，连接LAT52启动子到双元表达载体pBI121，转化农杆菌GV3101，用农杆菌浸染法侵染甘蓝幼苗下胚轴，获得2株阳性植株，对转基因甘蓝植株的花蕾、花药及花粉进行GUS染色。[结果] LAT52核心序列608 bp具多个与花粉特异性表达相关的元件，浸染的LAT52启动子仅在花药及花粉中表达出蓝色，其他部位未染上蓝色。[结论] LAT52启动子仅在甘蓝花药及花粉中特异性表达。
关键词LAT52启动子；甘蓝；花药；GUS；表达模式
中图分类号S635文献标识码A文章编号0517-6611（2016）30-0104-04
花粉萌发和花粉管伸长是开花植物的重要生理过程，花粉发育过程中的基因表达被分为早期和晚期2个阶段。目前已从多种植物中分离得到花粉特异性启动子，如番茄[1]、玉米[2]、土豆[3-4]、水稻[5]等。从番茄成熟花粉粒cDNA文库中筛选鉴定出4个基因：LAT51、LAT52、LAT58及LAT59，均属于晚基因，其mRNA在有丝分裂后出现，开花期含量达到最高。LAT52在花粉成熟和花粉管伸长早期直接表达组织原位杂交结果表明，其内源mRNA除在花粉粒中表达外，也在花药组织中表达[6-7]。LAT52启动子具高度小孢子特异性，LAT52-barnase转基因导致植物在单细胞小孢子阶段发生细胞程序性死亡[8]；Oldenhof等[9]利用Northern分析表明，LAT52启动子仅在单细胞小孢子中检测到。虽然番茄LAT52基因启动子被发现较早[1，6]，但在最新的花粉研究中仍被广泛应用。Grant-Downton等[10]构建了LAT52启动下的人工小RNA（artificial MICRORNA）在拟南芥中有效发挥，其在小孢子发育晚期表达且随后在营养细胞积累；Guan等[11]构建了LAT52启动下的gMPK6-YFP表达盒，并转化mpk3-/-mpk6-/-胚芽致死双突变体，
利用荧光标记技术观察含mpk3 mpk6双突变体的拟南芥花粉管生长情况，结果表明，拟南芥花粉管正常生长，但mpk3 mpk6双突变体使引导花粉正常运输的信号机制功能受损；Gupta等[12]将LAT52-PTEN1的RNAI载体转入拟南芥，显微观察显示大量成熟花粉粒存在缺陷，表明PTEN1基因是花粉发育所必需的；Guan等[13]构建了LAT52：：4myc-WRKY34，表明其在花粉二细胞阶段发生磷酸化，而在三细胞阶段发生去磷酸化，WRKY34的磷酸化对雄配子体发育的生物功能起到重要作用；Yu等[14]利用花粉特异性启动子LAT52，构建了云杉HAP5RNAi和FKBP12 RNAI，结果表明，HAP5改变了花粉管的生长方向，并证明HAP5和FKBP12存在相互作用以调控花粉管发育及定位；Leydon等[15]将LAT52：DsRED、LAT52：GUS等一系列转基因植株的花粉管进行检测，结果表明，助细胞退化，花粉管伸长未启动，并指出未授粉的基本发育途径介导的助细胞退化。表明LAT52启动子在花粉發育及其他相关生化过程中有重要的应用。
结球甘蓝（Brassica oleracea L.）在世界各地普遍种植，是欧美各国主要蔬菜，也是我国主要蔬菜之一。甘蓝因具自交不亲和性，目前对甘蓝花粉萌发和花粉管伸长方面的研究较多，而LAT52启动子在甘蓝花粉发育过程中的作用鲜见报道。笔者将LAT52启动子驱动的GUS报告基因转化甘蓝，验证该启动子能否在甘蓝花药中特异性启动下基因表达，以期为甘蓝花粉萌发和花粉管伸长的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
甘蓝品种寒胜购自重庆三千种业有限公司；双元表达载体pBI121（含35S启动子、GUS报告基因）、农杆菌GV3101于云南农业大学滇台中心分子生物学实验室保存；PEASY Blunt simple克隆载体、Trans T1感受态细胞、TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2试验方法
1.2.1
引物设计。根据NCBI中番茄（SOLANUM LYCOPERSICUM）花药特异性启动子LAT52序列（GenBank：X15855.1）设计引物LAT52-F：GCGCAAGCTTGGTGTCGACATACTCGACTCAGAAGG，LAT52-R：GAATTGAACGCGGCAAGTATCACAG，LAT52-inner：GCGCGGATCCTAAATTGGAATTTTTTTTTTTG，上下游引物分别加入Hind III和BamH I酶切位点。
1.2.2
LAT52启动子的克隆及亚克隆。以番茄gDNA为模板，以LAT52-F/LAT52-R为引物。反应体系：ddH2O 14.0 μL，5×PCR 缓冲液（Mg2+）5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，引物各1.0 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，稀释模板DNA 1.0 μL。PCR 扩增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环。连接克隆载体PEASY Blunt simple，PCR检测，并测序。以测序正确的片段为模板，LAT52-F/LAT52-inner为引物亚克隆得到LAT52片段，测序并命名为pB-LAT52。
1.2.3
番茄LAT52启动子与GUS融合表达载体构建。将测序正确的pB-LAT52质粒和pBI121表达质粒经Hind III和BamH I双酶切后回收目的片段，连接构建带有卡那霉素（NPT II）抗性的表达载体pBI-LAT52（图1），以转化pBI121阳性质粒的菌株为阳性对照，以非转化植株为阴性对照。 1.2.4
甘蓝下胚轴浸染及抗性植株再生。将下胚轴切成
1 cm左右的小段，预培养2 d，浸入重悬浮菌液中浸染5 min，期间不断摇动，于无菌滤纸上吸干菌液，转入共培养基培养，25 ℃暗培养2 d，再移入含有卡那霉素选择培养基上筛选，培养温度25 ℃，光照时间16 h/d。将未转化成功的下胚轴转入新选择培养基，当长至1 cm以上时，将其切下转入生根培养基。
1.2.5
GUS组织化学染色检测。GUS组织化学染色参考Jefferson等[16]的方法。将转基因甘蓝、阳性对照、阴性对照的花蕾、花药及花粉分别置于X-GLUC染色液中，真空抽气30 min，37 ℃放置过夜，用70%乙醇进行脱色洗去叶绿素，至阴性对照呈白色，电子显微镜下观察拍照，蓝色部分即为GUS基因的表达位点。
2结果与分析
2.1番茄LAT52启动子的克隆
番茄gDNA以LAT52-F/LAT52-R扩增得到LAT52，片段大小为736 bp（圖2），以LAT52-F/LAT52-inner复制得到片段大小为608 bp（图2B），表明该片段与LAT52（GENBANK：X15855.1）极度相似，差别只在于增加了7个碱基ATAAAAA，且属于高度重复片段[17]。说明正确克隆了LAT52启动子核心区域。
2.2番茄LAT52启动子序列分析
测定PLANTCARE和PLACE片段序列，结果见图3。由图3可知，该序列含有代表性的CAAT-box和TATA-box，CCACAAAAA为LAT52所含片段[18]，含大量调控花药生长相关的作用片段，如GTGA-box、POLLEN1LeLAT52（AGAAA-box）、TCATTT-box，以及特定调控花粉的片段、2个GTGA元件和2个AGAAA等[19-20]。此外还含有提高调控花粉特定表达能力的TGTGG-box。
2.3LAT52表达载体构建
将构建好的双元表达载体pBI-LAT52和对照质粒，通过冻融法转化农杆菌GV3101感受态细胞，培养2～3 d，挑取单菌落进行PCR检测，结果得到大小约为600 bp的条带，与目的基因大小一致，说明pBI-LAT52载体成功转化至农杆菌中。
2.4转基因甘蓝植株的分子验证
通过组织培养抗性筛选，共获得8株抗性植株，将长出真叶的幼苗及对照材料分别提取gDNA，使用LAT52-F/LAT52-inner引物对8株转基因材料进行PCR检测，结果表明，2号和3号植株扩增出大小正确的条带，说明这2株为转基因阳性植株（图4）。
2.5番茄LAT52启动子在甘蓝中的表达模式
对检测正确的pBI-LAT52植株、阳性植株进行GUS染色。结果显示，pBI-LAT52完整移入植株中，仅LAT52花粉特异性启动子引导下游GUS报告基因表达（图5A、B）。进一步对花粉进行GUS染色，结果显示，花粉中部分变蓝，而阴性对照均未染色（图5C），pBI121质粒所在花蕾中，各部分成功变蓝。表明LAT52启动子在花粉中行使其功能。
3结论与讨论
植物开花过程中的花药和花粉发育是必经阶段，在此过程中有大量基因在不同时空表达，其中包含大量花药与花粉特异性及相关表达基因的研究，花粉组织特异性启动子在花粉发育过程中起重要作用。花粉发育相关的特异性启动子有TA29、LAT52、Osg6B、Zm13、S1等。对番茄LAT52启动子的研究发现，-3 000～-492 bp区域与启动子活性无关，-492～-145 bp和 -124～-86 bp区域有增强表达的作用，而-71～100 bp区段足以启动基因在花粉中特异表达[1，6，21]。该研究扩增得到具有增强表达和启动作用的区域，包括花粉特异基因时空表达的GTGA-box、POLLEN1LeLAT52（AGAAA-box）及TCATTT-box；同时含有与花粉特异性表达相关的顺式作用元件GTGA-box和AGAAA-box[19-20]；此外还含有具有增强花粉特异性表达的作用的TGTGG-box。
LAT52启动子最初在番茄中得到克隆并进行了功能验证，随后又在其他物种中得到了确认。Francis等[22]将LAT52：XFP载体通过农杆菌蘸花转化拟南芥，在T1代转基因植株花粉四分体时期检测到不同颜色的荧光；Tang等[23]构建了LAT52驱动的LAT52-GFPN转化拟南芥花粉质体，在转基因拟南芥T3代成熟花粉中检测到GFP荧光。该研究对分别转基因甘蓝的花蕾、花药及花粉进行GUS染色，结果转pBI-LAT52的植株仅在花药部分染出蓝色，花蕾的其他组织中未染色，说明pBI-LAT52质粒成功转入植株中，且番茄LAT52花粉特异性启动子在甘蓝花药及花粉中启动GUS基因的表达，而在其他部位组织中无法启动。在转化阳性对照植株的花蕾中，花药、花瓣、萼片、柱头及花梗均染上蓝色，而阴性对照均未染上蓝色。该研究结果与其他研究结果一致，说明LAT52启动子能够在甘蓝花药中特异性启动目的基因的表达，该研究可为甘蓝花粉萌发及花粉管伸长机理的研究提供参考。
参考文献
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关键词LAT52启动子；甘蓝；花药；GUS；表达模式
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花粉萌发和花粉管伸长是开花植物的重要生理过程，花粉发育过程中的基因表达被分为早期和晚期2个阶段。目前已从多种植物中分离得到花粉特异性启动子，如番茄[1]、玉米[2]、土豆[3-4]、水稻[5]等。从番茄成熟花粉粒cDNA文库中筛选鉴定出4个基因：LAT51、LAT52、LAT58及LAT59，均属于晚基因，其mRNA在有丝分裂后出现，开花期含量达到最高。LAT52在花粉成熟和花粉管伸长早期直接表达组织原位杂交结果表明，其内源mRNA除在花粉粒中表达外，也在花药组织中表达[6-7]。LAT52启动子具高度小孢子特异性，LAT52-barnase转基因导致植物在单细胞小孢子阶段发生细胞程序性死亡[8]；Oldenhof等[9]利用Northern分析表明，LAT52启动子仅在单细胞小孢子中检测到。虽然番茄LAT52基因启动子被发现较早[1，6]，但在最新的花粉研究中仍被广泛应用。Grant-Downton等[10]构建了LAT52启动下的人工小RNA（artificial MICRORNA）在拟南芥中有效发挥，其在小孢子发育晚期表达且随后在营养细胞积累；Guan等[11]构建了LAT52启动下的gMPK6-YFP表达盒，并转化mpk3-/-mpk6-/-胚芽致死双突变体，
利用荧光标记技术观察含mpk3 mpk6双突变体的拟南芥花粉管生长情况，结果表明，拟南芥花粉管正常生长，但mpk3 mpk6双突变体使引导花粉正常运输的信号机制功能受损；Gupta等[12]将LAT52-PTEN1的RNAI载体转入拟南芥，显微观察显示大量成熟花粉粒存在缺陷，表明PTEN1基因是花粉发育所必需的；Guan等[13]构建了LAT52：：4myc-WRKY34，表明其在花粉二细胞阶段发生磷酸化，而在三细胞阶段发生去磷酸化，WRKY34的磷酸化对雄配子体发育的生物功能起到重要作用；Yu等[14]利用花粉特异性启动子LAT52，构建了云杉HAP5RNAi和FKBP12 RNAI，结果表明，HAP5改变了花粉管的生长方向，并证明HAP5和FKBP12存在相互作用以调控花粉管发育及定位；Leydon等[15]将LAT52：DsRED、LAT52：GUS等一系列转基因植株的花粉管进行检测，结果表明，助细胞退化，花粉管伸长未启动，并指出未授粉的基本发育途径介导的助细胞退化。表明LAT52启动子在花粉發育及其他相关生化过程中有重要的应用。
结球甘蓝（Brassica oleracea L.）在世界各地普遍种植，是欧美各国主要蔬菜，也是我国主要蔬菜之一。甘蓝因具自交不亲和性，目前对甘蓝花粉萌发和花粉管伸长方面的研究较多，而LAT52启动子在甘蓝花粉发育过程中的作用鲜见报道。笔者将LAT52启动子驱动的GUS报告基因转化甘蓝，验证该启动子能否在甘蓝花药中特异性启动下基因表达，以期为甘蓝花粉萌发和花粉管伸长的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
甘蓝品种寒胜购自重庆三千种业有限公司；双元表达载体pBI121（含35S启动子、GUS报告基因）、农杆菌GV3101于云南农业大学滇台中心分子生物学实验室保存；PEASY Blunt simple克隆载体、Trans T1感受态细胞、TransStart FastPfu Fly DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2试验方法
1.2.1
引物设计。根据NCBI中番茄（SOLANUM LYCOPERSICUM）花药特异性启动子LAT52序列（GenBank：X15855.1）设计引物LAT52-F：GCGCAAGCTTGGTGTCGACATACTCGACTCAGAAGG，LAT52-R：GAATTGAACGCGGCAAGTATCACAG，LAT52-inner：GCGCGGATCCTAAATTGGAATTTTTTTTTTTG，上下游引物分别加入Hind III和BamH I酶切位点。
1.2.2
LAT52启动子的克隆及亚克隆。以番茄gDNA为模板，以LAT52-F/LAT52-R为引物。反应体系：ddH2O 14.0 μL，5×PCR 缓冲液（Mg2+）5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，引物各1.0 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，稀释模板DNA 1.0 μL。PCR 扩增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环。连接克隆载体PEASY Blunt simple，PCR检测，并测序。以测序正确的片段为模板，LAT52-F/LAT52-inner为引物亚克隆得到LAT52片段，测序并命名为pB-LAT52。
1.2.3
番茄LAT52启动子与GUS融合表达载体构建。将测序正确的pB-LAT52质粒和pBI121表达质粒经Hind III和BamH I双酶切后回收目的片段，连接构建带有卡那霉素（NPT II）抗性的表达载体pBI-LAT52（图1），以转化pBI121阳性质粒的菌株为阳性对照，以非转化植株为阴性对照。 1.2.4
甘蓝下胚轴浸染及抗性植株再生。将下胚轴切成
1 cm左右的小段，预培养2 d，浸入重悬浮菌液中浸染5 min，期间不断摇动，于无菌滤纸上吸干菌液，转入共培养基培养，25 ℃暗培养2 d，再移入含有卡那霉素选择培养基上筛选，培养温度25 ℃，光照时间16 h/d。将未转化成功的下胚轴转入新选择培养基，当长至1 cm以上时，将其切下转入生根培养基。
1.2.5
GUS组织化学染色检测。GUS组织化学染色参考Jefferson等[16]的方法。将转基因甘蓝、阳性对照、阴性对照的花蕾、花药及花粉分别置于X-GLUC染色液中，真空抽气30 min，37 ℃放置过夜，用70%乙醇进行脱色洗去叶绿素，至阴性对照呈白色，电子显微镜下观察拍照，蓝色部分即为GUS基因的表达位点。
2结果与分析
2.1番茄LAT52启动子的克隆
番茄gDNA以LAT52-F/LAT52-R扩增得到LAT52，片段大小为736 bp（圖2），以LAT52-F/LAT52-inner复制得到片段大小为608 bp（图2B），表明该片段与LAT52（GENBANK：X15855.1）极度相似，差别只在于增加了7个碱基ATAAAAA，且属于高度重复片段[17]。说明正确克隆了LAT52启动子核心区域。
2.2番茄LAT52启动子序列分析
测定PLANTCARE和PLACE片段序列，结果见图3。由图3可知，该序列含有代表性的CAAT-box和TATA-box，CCACAAAAA为LAT52所含片段[18]，含大量调控花药生长相关的作用片段，如GTGA-box、POLLEN1LeLAT52（AGAAA-box）、TCATTT-box，以及特定调控花粉的片段、2个GTGA元件和2个AGAAA等[19-20]。此外还含有提高调控花粉特定表达能力的TGTGG-box。
2.3LAT52表达载体构建
将构建好的双元表达载体pBI-LAT52和对照质粒，通过冻融法转化农杆菌GV3101感受态细胞，培养2～3 d，挑取单菌落进行PCR检测，结果得到大小约为600 bp的条带，与目的基因大小一致，说明pBI-LAT52载体成功转化至农杆菌中。
2.4转基因甘蓝植株的分子验证
通过组织培养抗性筛选，共获得8株抗性植株，将长出真叶的幼苗及对照材料分别提取gDNA，使用LAT52-F/LAT52-inner引物对8株转基因材料进行PCR检测，结果表明，2号和3号植株扩增出大小正确的条带，说明这2株为转基因阳性植株（图4）。
2.5番茄LAT52启动子在甘蓝中的表达模式
对检测正确的pBI-LAT52植株、阳性植株进行GUS染色。结果显示，pBI-LAT52完整移入植株中，仅LAT52花粉特异性启动子引导下游GUS报告基因表达（图5A、B）。进一步对花粉进行GUS染色，结果显示，花粉中部分变蓝，而阴性对照均未染色（图5C），pBI121质粒所在花蕾中，各部分成功变蓝。表明LAT52启动子在花粉中行使其功能。
3结论与讨论
植物开花过程中的花药和花粉发育是必经阶段，在此过程中有大量基因在不同时空表达，其中包含大量花药与花粉特异性及相关表达基因的研究，花粉组织特异性启动子在花粉发育过程中起重要作用。花粉发育相关的特异性启动子有TA29、LAT52、Osg6B、Zm13、S1等。对番茄LAT52启动子的研究发现，-3 000～-492 bp区域与启动子活性无关，-492～-145 bp和 -124～-86 bp区域有增强表达的作用，而-71～100 bp区段足以启动基因在花粉中特异表达[1，6，21]。该研究扩增得到具有增强表达和启动作用的区域，包括花粉特异基因时空表达的GTGA-box、POLLEN1LeLAT52（AGAAA-box）及TCATTT-box；同时含有与花粉特异性表达相关的顺式作用元件GTGA-box和AGAAA-box[19-20]；此外还含有具有增强花粉特异性表达的作用的TGTGG-box。
LAT52启动子最初在番茄中得到克隆并进行了功能验证，随后又在其他物种中得到了确认。Francis等[22]将LAT52：XFP载体通过农杆菌蘸花转化拟南芥，在T1代转基因植株花粉四分体时期检测到不同颜色的荧光；Tang等[23]构建了LAT52驱动的LAT52-GFPN转化拟南芥花粉质体，在转基因拟南芥T3代成熟花粉中检测到GFP荧光。该研究对分别转基因甘蓝的花蕾、花药及花粉进行GUS染色，结果转pBI-LAT52的植株仅在花药部分染出蓝色，花蕾的其他组织中未染色，说明pBI-LAT52质粒成功转入植株中，且番茄LAT52花粉特异性启动子在甘蓝花药及花粉中启动GUS基因的表达，而在其他部位组织中无法启动。在转化阳性对照植株的花蕾中，花药、花瓣、萼片、柱头及花梗均染上蓝色，而阴性对照均未染上蓝色。该研究结果与其他研究结果一致，说明LAT52启动子能够在甘蓝花药中特异性启动目的基因的表达，该研究可为甘蓝花粉萌发及花粉管伸长机理的研究提供参考。
参考文献
[1] TWELL D，YAMAGUCHI J，MCCORMICK S，et al.Pollenspecific gene expression in transgenic plants：coordinate regulation of two different tomato gene promoters during microsporogenesis[J].Development，1990，109（3）：705-713.
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