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摘要：以龙葵为试验材料，利用RT-PCR技术分离到2个长度不同的编码Ⅱ类MT(金属硫蛋白)的CDNA克隆SorMT2a(EU760481)和SorMT2c(EU760483)，成功构建植物表达载体pROKⅡ-SorMT2a和pROKⅡ-SorMT2c，通过农杆菌介导法转化烟草并通过PCR验证了基因的表达情况。与野生植株相比，转SorMT2a和SorMT2c基因烟草对镉的耐受性不同，有的转SorMT2a基因植株在MS培养基中的CdCl2浓度达到200μmol／L时仍然生长良好，生物量和株高均大于野生型植株；而转SorMT2c基因植株对镉的耐受性没有提高。这说明SorMT2a基因在植物对镉的耐受性中起作用，而SorMT2c基因则不起作用，从而也说明了同一类基因不同家族可能具有不同功能。
关键词：龙葵；金属硫蛋白；重金属；RT-PCR；SorMT2a；SorMT2c
中图分类号：Q785；Q949.777.7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942(2010)12-0001-05
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类富含半胱氨酸、不含组氨酸和芳香族氨基酸、无二硫键的小分子细胞内金属结合蛋白，在重金属解毒和重金属稳态维持中具有重要作用，是首次从马的肾脏中分离出来并命名的。植物金属硫蛋白的发现相对较晚，目前已分离纯化的植物金属硫蛋白只有小麦Ec蛋白和拟南芥的MT1、MT2和MT3。很多研究表明，MT mRNA的累积量与某些金属离子的诱导呈正相关。迄今为止，在拟南芥、水稻、小麦、大豆、棉花、玉米、番茄、辣椒、马铃薯等植物中均克隆到了MT基因cDNA或基因组序列。转小鼠MT的烟草中，接近20％的植株可以在200μmol／L镉下正常生长，而对照野生烟草在10μmol／L镉下生长便受到严重抑制。将麦瓶草的MThis转到烟草中，提高了其根和叶对镉的积累量。
龙葵(Solanum nigrum L)属茄科茄属龙葵亚属植物，是我国新近发现的一种重金属镉超积累植物。近年来，人们对龙葵的研究主要集中在镉耐受性和生理特性方面，而对与龙葵镉耐受有关的基因——金属硫蛋白基因的克隆和研究，目前尚未见报道。本研究经同源克隆获得了龙葵2个长度不同的Ⅱ类金属硫蛋白基因的cDNA序列SorMT2a和SorMT2c，并将其转到烟草中，分析了其对植物镉耐受性的作用，为研究龙葵MT基因的功能奠定了基础，并为运用植物修复技术清除土壤中的镉提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
植物和菌株：龙葵和烟草种子由山东省农业科学院高新技术研究中心提供。克隆载体pMD18-T Vector购自TAKARA公司。大肠杆菌DH5a、农杆菌LBA4404及植物表达载体pROKⅡ由山东省农业科学院高新技术研究中心保存。
主要工具酶及试剂盒：总RNA抽提试剂盒(北京GenStar)、反转录试剂盒(TransGen Bio-tech)、DNA凝胶回收试剂盒(北京百泰克)、质粒提取试剂盒(北京百泰克)、限制性内切酶Xba I和kpn I及连接酶T4 DNA Ligase(TAKARA)、Taq DNA Polymerase(Fermentas)等。
1.2 方法
1.2.1 龙葵MT cDNA的克隆登录GenBank数据库，根据公布的番茄等Ⅱ类MT氨基酸和基因保守序列，设计了两对简并引物：(1)P1-F：5′-ATGTCKTGCTGTGGAARCTG-3′P1一R：5′-CTACTTAGARCAAGTGCAAGGGTF-3；(2)P2-F：5′-ATGTCKTGCTGTGGAARCTG-3′，P2-R：5′-CTARCARKTGCAAGGGTCRCAYKT-3′。以龙葵总RNA为模板，用反转录试剂盒合成CD-NA。以合成的单链eDNA为模板，通过RT-PCR方法扩增龙葵MT基因，反应程序为：94℃，5min；94℃，1min.52℃，1min，72℃，1min，34个循环；72℃，5min。扩增结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的基因片段，DNA凝胶提取试剂盒进行回收。调制连接反应液(10μl体系)，16℃连接3h，连接到pMD18-T Vector上。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用蓝白斑法筛选转化子，对白色菌落进行菌液PCR验证。将可扩增出目的条带的阳性菌液送上海生物工程技术公司测序。
1.2.2 转龙葵MT2烟草及镉耐受性分析 根据SorMT2和pROKⅡ(图1)的多克隆位点(MultipleCloning Site，MCS)核苷酸序列，设计了如下2对引物，分别扩增SorMT2a和SorMT2c的ORF：P3-F：5′-GCtcgaATGTCTTGCTGTGG-3′和P3-R：5′-GgggtaccCTACTFAGAGCAAG′，P4-F：5′-GCtctagaATGTCq'TGCTGTGG′和P4-R：5′-GgggtaccCTAACAATTGCAAG′，其中的小写字母分别表示Xba I和Kpn I的酶切位点。
根据载体序列，设计了一对引物(位于载体MCS两侧)：pROKⅡ-C657：5′-GTAACGC-CAGGGTITFCCCAG-3′，pROKⅡ-C834：5′-GACCCTrCCTCTATATAAGG-3′(35S promoter)。分别以测序正确的质粒pMD18-SorMT2a、pMD18-SorMT2c为模板，P3-F、P3-R及P4-F、P4-R为引物进行PCR，特异性扩增目的基因SorMT2a和SorMT2c。将扩出的目的基因连到T载体上，并进行测序，然后将测序正确的质粒用Xba I和Kpn I进行双酶切，回收酶切产物，将其与同样双酶切的植物表达载体pROKⅡ连接，然后通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆，提取质粒，进行PCR验证，将验证正确的质粒转到农杆菌LBA4404感受态细胞中。
用农杆菌侵染转化烟草，参照Homh等的方法并有所修改：取无菌培养瓶中烟草叶片，剪成边长约为0.5cm的小方块，用含有SorMT2a和SorMT2c表达载体的农杆菌菌液浸泡1.5min，期间不时轻轻晃动；取出侵染的叶片，用无菌滤纸吸干，然后将其放入MS分化培养基(MS+1mg／L6-BA+0.1 mg／LNAA)上28℃暗培养2d；经共培养的叶片再转入选择培养基(MS+150mg／L卡那霉素+300mg／L头孢霉素)上进行选择培养，每两周继代一次；待抗性芽长到1cm以上时，切下小芽并切除芽基部的愈伤组织，转移到MS生长培养基上；待植株长到2～3cm时，转到1／2MS生根培养基中进行生根培养。
CTAB法提取烟草叶片总DNA，以总DNA为 模板进行PCR鉴定，其中，检测转空载体pROKⅡ和转SorMT2a、SorMT2c基因植株的引物对分别为一对卡那抗性引物、pROKⅡ-C834和P3-R、P4-F和P4-R。按下列程序进行反应：94℃，5min；94℃，45s，55℃，45s，72℃，1min，34个循环；72℃，5min。扩增结束后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
各取15株转基因烟草株系，切茎段，插入含有不同浓度(0、100、200、400μmol／L)CdCl的MS培养基中，生长30天后，观察其生长情况并测定生物量和叶绿素含量，进行初步的镉耐受性试验。利用SAS(8.2)软件，通过AVOVA统计分析检测生理指标的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 重组质粒的序列测定
将鉴定的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并用DNAStar生物软件去除载体序列，结果显示获得的基因长度分别为249bp(SorMT2a)和234 bp(SorMT2c)，在GenBank上的登录号分别为EU760481和EU760483。
2.2 PCR鉴定转SorMT2a和SorMT2c烟草株系
以转基因和野生型烟草植株的基因组DNA为模板进行PCR鉴定，结果显示，质粒pROKⅡ、阳性质粒pROKⅡ-SorMT2a、阳性质粒pROKⅡ-SorMT2c和转基因株系均出现与插入片段大小相符的条带，而野生型植株和水对照则无目的条带(图2～4)，初步证明质粒pROKⅡ和携带目的基因SorMT2a和SorMT-2c的质粒pROKⅡ-SorMT2a、pROKⅡ-SorMT2c均插入到烟草植株中。
2.3 转基因烟草植株的镉耐受性分析
从图5可以看出，随着CdCl2浓度的升高，野生型和各转基因烟草植株的生物量均呈现下降趋势，但转基因烟草生物量下降得较缓慢。镉浓度为100μmol／L时，转基因烟草和野生型烟草生物量差异不明显。在CdCl2浓度升高到200μmol／L时，野生型总生物量下降了75.05％，而转SorMT2a基因植株总生物量下降41.40％，较野生型少33.65个百分点，差异极显著，受Cd毒害最轻；转SorMT2c基因总生物量下降63.26％，较野生型少11.79个百分点，差异也达到极显著水平，受Cd2+毒害也较轻。
由图6可以看出，随着CdCl浓度的增加，烟草植株叶绿素含量逐渐减少，植物的光系统受到了破坏；在CdCl浓度为200μmol／L时，四种烟草株系叶绿素含量分别下降了54.06％、17.34％、54.56％和54.21％，转SorMT2a基因植株光系统受到的破坏比较小。
3 讨论
在对转基因植株进行PCR鉴定时发现，在含抗生素的培养基上筛选得到的植株PCR鉴定基本都为阳性。说明本试验设计比较合理，适合烟草转化，但在转基因的过程中发现愈伤组织呈现黄色，与以往报道的愈伤组织呈现绿色的结果不同，这可能与载体有一定的关系。
试验结果显示，转SorMT2a基因植株对Cd2+的耐性可达200μmol／L，可以初步推测SorMT2a基因在解除植物的Cd2+毒性中发挥一定作用；而SorMT2c基因可能在植物对镉的耐受性中不起作用。这可能是该基因家族丰富性的一个原因，即不同的金属硫蛋白基因在植物的生长发育过程中执行不同的功能，发挥不同的作用。Quan等从花生(Arachis hypogaea L)中克隆到7个金属硫蛋白基因，并把AhMt2a转入拟南芥中，发现过量表达该基因的拟南芥对Cd2+的耐受性明显增强，与本研究结果一致。
龙葵MT基因转入烟草后提高其对重金属镉的耐受性机理尚不清楚，MT基因的插入是否导致某些基因失活；MT除了与Cd2+形成结合态镉外，是否还有其他解毒方式和功能；MT与Cd2+的确切关系如何等，都有待于进一步深入研究。另外，深入研究龙葵MT基因的基因组结构及顺式作用元件和反式作用因子，通过转基因技术调控龙葵MT基因的表达、分离筛选突变体等工作，都是未来镉超积累植物龙葵研究的重要课题。
关键词：龙葵；金属硫蛋白；重金属；RT-PCR；SorMT2a；SorMT2c
中图分类号：Q785；Q949.777.7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942(2010)12-0001-05
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类富含半胱氨酸、不含组氨酸和芳香族氨基酸、无二硫键的小分子细胞内金属结合蛋白，在重金属解毒和重金属稳态维持中具有重要作用，是首次从马的肾脏中分离出来并命名的。植物金属硫蛋白的发现相对较晚，目前已分离纯化的植物金属硫蛋白只有小麦Ec蛋白和拟南芥的MT1、MT2和MT3。很多研究表明，MT mRNA的累积量与某些金属离子的诱导呈正相关。迄今为止，在拟南芥、水稻、小麦、大豆、棉花、玉米、番茄、辣椒、马铃薯等植物中均克隆到了MT基因cDNA或基因组序列。转小鼠MT的烟草中，接近20％的植株可以在200μmol／L镉下正常生长，而对照野生烟草在10μmol／L镉下生长便受到严重抑制。将麦瓶草的MThis转到烟草中，提高了其根和叶对镉的积累量。
龙葵(Solanum nigrum L)属茄科茄属龙葵亚属植物，是我国新近发现的一种重金属镉超积累植物。近年来，人们对龙葵的研究主要集中在镉耐受性和生理特性方面，而对与龙葵镉耐受有关的基因——金属硫蛋白基因的克隆和研究，目前尚未见报道。本研究经同源克隆获得了龙葵2个长度不同的Ⅱ类金属硫蛋白基因的cDNA序列SorMT2a和SorMT2c，并将其转到烟草中，分析了其对植物镉耐受性的作用，为研究龙葵MT基因的功能奠定了基础，并为运用植物修复技术清除土壤中的镉提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
植物和菌株：龙葵和烟草种子由山东省农业科学院高新技术研究中心提供。克隆载体pMD18-T Vector购自TAKARA公司。大肠杆菌DH5a、农杆菌LBA4404及植物表达载体pROKⅡ由山东省农业科学院高新技术研究中心保存。
主要工具酶及试剂盒：总RNA抽提试剂盒(北京GenStar)、反转录试剂盒(TransGen Bio-tech)、DNA凝胶回收试剂盒(北京百泰克)、质粒提取试剂盒(北京百泰克)、限制性内切酶Xba I和kpn I及连接酶T4 DNA Ligase(TAKARA)、Taq DNA Polymerase(Fermentas)等。
1.2 方法
1.2.1 龙葵MT cDNA的克隆登录GenBank数据库，根据公布的番茄等Ⅱ类MT氨基酸和基因保守序列，设计了两对简并引物：(1)P1-F：5′-ATGTCKTGCTGTGGAARCTG-3′P1一R：5′-CTACTTAGARCAAGTGCAAGGGTF-3；(2)P2-F：5′-ATGTCKTGCTGTGGAARCTG-3′，P2-R：5′-CTARCARKTGCAAGGGTCRCAYKT-3′。以龙葵总RNA为模板，用反转录试剂盒合成CD-NA。以合成的单链eDNA为模板，通过RT-PCR方法扩增龙葵MT基因，反应程序为：94℃，5min；94℃，1min.52℃，1min，72℃，1min，34个循环；72℃，5min。扩增结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的基因片段，DNA凝胶提取试剂盒进行回收。调制连接反应液(10μl体系)，16℃连接3h，连接到pMD18-T Vector上。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用蓝白斑法筛选转化子，对白色菌落进行菌液PCR验证。将可扩增出目的条带的阳性菌液送上海生物工程技术公司测序。
1.2.2 转龙葵MT2烟草及镉耐受性分析 根据SorMT2和pROKⅡ(图1)的多克隆位点(MultipleCloning Site，MCS)核苷酸序列，设计了如下2对引物，分别扩增SorMT2a和SorMT2c的ORF：P3-F：5′-GCtcgaATGTCTTGCTGTGG-3′和P3-R：5′-GgggtaccCTACTFAGAGCAAG′，P4-F：5′-GCtctagaATGTCq'TGCTGTGG′和P4-R：5′-GgggtaccCTAACAATTGCAAG′，其中的小写字母分别表示Xba I和Kpn I的酶切位点。
根据载体序列，设计了一对引物(位于载体MCS两侧)：pROKⅡ-C657：5′-GTAACGC-CAGGGTITFCCCAG-3′，pROKⅡ-C834：5′-GACCCTrCCTCTATATAAGG-3′(35S promoter)。分别以测序正确的质粒pMD18-SorMT2a、pMD18-SorMT2c为模板，P3-F、P3-R及P4-F、P4-R为引物进行PCR，特异性扩增目的基因SorMT2a和SorMT2c。将扩出的目的基因连到T载体上，并进行测序，然后将测序正确的质粒用Xba I和Kpn I进行双酶切，回收酶切产物，将其与同样双酶切的植物表达载体pROKⅡ连接，然后通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆，提取质粒，进行PCR验证，将验证正确的质粒转到农杆菌LBA4404感受态细胞中。
用农杆菌侵染转化烟草，参照Homh等的方法并有所修改：取无菌培养瓶中烟草叶片，剪成边长约为0.5cm的小方块，用含有SorMT2a和SorMT2c表达载体的农杆菌菌液浸泡1.5min，期间不时轻轻晃动；取出侵染的叶片，用无菌滤纸吸干，然后将其放入MS分化培养基(MS+1mg／L6-BA+0.1 mg／LNAA)上28℃暗培养2d；经共培养的叶片再转入选择培养基(MS+150mg／L卡那霉素+300mg／L头孢霉素)上进行选择培养，每两周继代一次；待抗性芽长到1cm以上时，切下小芽并切除芽基部的愈伤组织，转移到MS生长培养基上；待植株长到2～3cm时，转到1／2MS生根培养基中进行生根培养。
CTAB法提取烟草叶片总DNA，以总DNA为 模板进行PCR鉴定，其中，检测转空载体pROKⅡ和转SorMT2a、SorMT2c基因植株的引物对分别为一对卡那抗性引物、pROKⅡ-C834和P3-R、P4-F和P4-R。按下列程序进行反应：94℃，5min；94℃，45s，55℃，45s，72℃，1min，34个循环；72℃，5min。扩增结束后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
各取15株转基因烟草株系，切茎段，插入含有不同浓度(0、100、200、400μmol／L)CdCl的MS培养基中，生长30天后，观察其生长情况并测定生物量和叶绿素含量，进行初步的镉耐受性试验。利用SAS(8.2)软件，通过AVOVA统计分析检测生理指标的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 重组质粒的序列测定
将鉴定的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并用DNAStar生物软件去除载体序列，结果显示获得的基因长度分别为249bp(SorMT2a)和234 bp(SorMT2c)，在GenBank上的登录号分别为EU760481和EU760483。
2.2 PCR鉴定转SorMT2a和SorMT2c烟草株系
以转基因和野生型烟草植株的基因组DNA为模板进行PCR鉴定，结果显示，质粒pROKⅡ、阳性质粒pROKⅡ-SorMT2a、阳性质粒pROKⅡ-SorMT2c和转基因株系均出现与插入片段大小相符的条带，而野生型植株和水对照则无目的条带(图2～4)，初步证明质粒pROKⅡ和携带目的基因SorMT2a和SorMT-2c的质粒pROKⅡ-SorMT2a、pROKⅡ-SorMT2c均插入到烟草植株中。
2.3 转基因烟草植株的镉耐受性分析
从图5可以看出，随着CdCl2浓度的升高，野生型和各转基因烟草植株的生物量均呈现下降趋势，但转基因烟草生物量下降得较缓慢。镉浓度为100μmol／L时，转基因烟草和野生型烟草生物量差异不明显。在CdCl2浓度升高到200μmol／L时，野生型总生物量下降了75.05％，而转SorMT2a基因植株总生物量下降41.40％，较野生型少33.65个百分点，差异极显著，受Cd毒害最轻；转SorMT2c基因总生物量下降63.26％，较野生型少11.79个百分点，差异也达到极显著水平，受Cd2+毒害也较轻。
由图6可以看出，随着CdCl浓度的增加，烟草植株叶绿素含量逐渐减少，植物的光系统受到了破坏；在CdCl浓度为200μmol／L时，四种烟草株系叶绿素含量分别下降了54.06％、17.34％、54.56％和54.21％，转SorMT2a基因植株光系统受到的破坏比较小。
3 讨论
在对转基因植株进行PCR鉴定时发现，在含抗生素的培养基上筛选得到的植株PCR鉴定基本都为阳性。说明本试验设计比较合理，适合烟草转化，但在转基因的过程中发现愈伤组织呈现黄色，与以往报道的愈伤组织呈现绿色的结果不同，这可能与载体有一定的关系。
试验结果显示，转SorMT2a基因植株对Cd2+的耐性可达200μmol／L，可以初步推测SorMT2a基因在解除植物的Cd2+毒性中发挥一定作用；而SorMT2c基因可能在植物对镉的耐受性中不起作用。这可能是该基因家族丰富性的一个原因，即不同的金属硫蛋白基因在植物的生长发育过程中执行不同的功能，发挥不同的作用。Quan等从花生(Arachis hypogaea L)中克隆到7个金属硫蛋白基因，并把AhMt2a转入拟南芥中，发现过量表达该基因的拟南芥对Cd2+的耐受性明显增强，与本研究结果一致。
龙葵MT基因转入烟草后提高其对重金属镉的耐受性机理尚不清楚，MT基因的插入是否导致某些基因失活；MT除了与Cd2+形成结合态镉外，是否还有其他解毒方式和功能；MT与Cd2+的确切关系如何等，都有待于进一步深入研究。另外，深入研究龙葵MT基因的基因组结构及顺式作用元件和反式作用因子，通过转基因技术调控龙葵MT基因的表达、分离筛选突变体等工作，都是未来镉超积累植物龙葵研究的重要课题。