【摘 要】
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目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Myo10蛋白敲除稳定细胞系,探讨Myo10对结肠癌细胞SW620形态、增殖和细胞周期的影响。方法:根据sgRNA设计网站选择并合成5对针对人Myo10基因的sg
【机 构】
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武汉大学中南医院放化疗科/湖北省肿瘤生物学行为重点实验室/湖北省肿瘤医学临床研究中心/湖北省肿瘤放射治疗质量控制中心; 华中科技大学同济医学院基础医学院生理学系;
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(编号:81001099;81370070);武汉大学中南医院科技创新种子基金(编号:cxpy2017027)
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目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Myo10蛋白敲除稳定细胞系,探讨Myo10对结肠癌细胞SW620形态、增殖和细胞周期的影响。方法:根据sgRNA设计网站选择并合成5对针对人Myo10基因的sgRNA序列,经退火形成双链后,用T4DNA连接酶将其与经BsmBⅠ线性化的Lenti-CRISPR v2慢病毒载体连接,包装成病毒感染SW620细胞。经嘌呤霉素筛选后用Western Blot检测Myo10的表达,选择敲除效率最高的sgRNA序列,进行单克隆细胞筛选,最后再用Western Blot验证Myo10是否敲除。用显微镜、Rhodanmine phalloidin细胞染色观察细胞形态;CCK-8实验及流式细胞术检测细胞增殖及细胞周期变化。结果:经测序鉴定成功构建了5对sgRNA-LentiCRISPR v2慢病毒载体,嘌呤霉素筛选后得到Myo10完全敲除的SW620细胞系。敲除Myo10的SW620细胞形态变圆,其增殖能力明显减弱,细胞周期S期比例增加。结论:成功构建Myo10完全敲除的SW620稳定细胞系;Myo10可影响SW620细胞形态和增殖能力;该实验为后续深入探讨Myo10作为结直肠癌潜在靶向基因的机制研究奠定了基础。
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