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摘 要：用HPLC方法测试既能检测出其有效成份的含量，又能检测出相关杂质的相对大小和产品中顺反式的相对比例，提高了对10%斑蝥黄的质量控制措施。该方法采用正己烷：丙酮（93：7）作为流动相，用Si60作为色谱柱，线性相关系数为0.9999，回收率为99.3%。
关键词：正相高效液相色谱法、斑蝥黄 RSD 线性 回收率
斑蝥黄主要是作为一种着色剂，产品中顺反式虽然都有着色效果，但着色的效果有一定差异。在国内，10%斑蝥黄主要是用紫外分光光度法测定，对产品中顺反式比例也无明确的要求。在国外，对产品中杂质和顺反式都有较严格的要求。因此，根据市场要求建立了10%斑蝥黄的液相测试方法。
一、检测条件与方法
1.仪器和试剂
液相色谱仪WATERS 600-717-2996；超声水浴装置；氮气吹干装置；紫外可见分光光度计CARY100；玻璃仪器；正己烷（色谱纯）；丙酮（色谱纯）；氯仿（分析纯）；乙醇（分析纯）；BHT；斑蝥黄结晶（紫外测试含量为99.7%）；10%斑蝥黄。
2.方法
2.1对照溶液的制备
取0.03g的斑蝥黄结晶于100ml的容量瓶中，加入氯仿稀释到刻度，摇匀，为储备液。储备液可以在冰箱中避光保存2天。取1ml的储备液到50ml的容量瓶中，加入正己烷稀释到刻度，摇匀，为斑蝥黄结晶液相分析用对照溶液。取储备液1ml于100ml的容量瓶中，加入正己烷稀释到刻度，摇匀，为斑蝥黄结晶紫外含量测试溶液。紫外含量测试时，以正己烷为空白，在467nm处测试溶液的吸光度，并用下式计算斑蝥黄结晶的含量：
2.2样品溶液的制备
取0.2g的10%斑蝥黄样品（0.16-0.24g内）于250ml的容量瓶中，加入10ml的蒸馏水，0.5gBHT，在55℃的水浴中，超声处理5分钟，取出，加入氯仿100ml，乙醇100ml，摇匀，在常温水浴中超声处理5分中，取出后，加入氯仿稀释到刻度，摇匀。取该液5ml于50ml的容量瓶中，在氮气吹干装置上吹干，取出，加入氯仿2ml。超声溶解样品后，加入正己烷稀释到刻度，摇匀，为样品溶液。
2.3色谱条件
色谱柱：LiChrosorb Si60 250×4.0mm×4.6um
流动相：正己烷：丙酮=93：7
流速：1.5ml/min
检测波长：467nm
柱温：25℃
定量管：20ul
色谱稳定后，对照溶液及样品溶液在该色谱条件完成进样分析，得到相应的响应值，并利用外标法计算样品中斑蝥黄的含量。
2.4含量计算：
由于斑蝥黄中，顺式斑蝥黄和反式斑蝥黄均为有效含量，故峰面积F采用校正峰面积计算，计算方法为： （F斑蝥黄的校正峰面积，FE为反式斑蝥黄的峰面积，FZ为顺式斑蝥黄的峰面积，1.329顺反式校正因子）
其中：Fsample-为样品溶液中斑蝥黄的校正峰面积
mstandard-为斑蝥黄结晶的称样量，g
Cstandard-为斑蝥黄结晶的紫外含量，%
msample-为10%斑蝥黄样品称样量，g
Fstandard-为对照溶液中斑蝥黄的校正峰面积
2-为体积校正因子
二、结果与讨论
1.最佳波长选择
我首先用紫外分光光度计对斑蝥黄进行了扫描，扫描波长为400nm-540nm，结果可以看出其最大吸收峰在467nm。
2.流动相选择
我对不同流动相的不同配比进行了试验，最后选择正己烷：丙酮（93：7）作为本方法的流动相，在此条件下标准品和样品都有很好的分离度。
3.系统适应性图
分别取空白溶液、对照溶液按1.2.3规定色谱条件分别进样分析，得到色谱图，详见附图1 空白溶液色谱图 附图2 斑蝥黄结晶溶液色谱图。
从附图2中可以看出，E-Canthaxanthin和XZ-Canthaxanthin分离度达到了1.89，分离度符合测试要求，说明1.2.3色谱条件可以用于斑蝥黄测试。
4.线性测试
分别取对照溶液储备液0.2，0.6，1.0，1.4，1.8ml于50ml的容量瓶中，加入正己烷稀释到刻度，摇匀，在1.2.3色谱条件下完成进样分析。
5.精密度测试
测试方法：分别取约0.16g，0.20g，0.24g樣品各分三组按照1.2.2规定样品处理方法进行测试，次测试，样品的含量平均值为10.64%，RSD为0.90%，说明本文第一部分规定的液相测试方法测试斑蝥黄时具有良好的精密度，而且取样量从0.16-0.24均不会对测试结果产生明显响应。
6.回收率测试
数据分析：9次回收率平均值为：99.3%，可以看出该测试方法对10%益生红素测试回收率良好，能够满足正常测试要求。
三、结论
综上所述，10%斑蝥黄HPLC测试方法精密度好，回收率高，得到的测试结果准确可靠，是一种准确、快速、简便的分析方法。
根据2.5精度测试中可以看出取样量从0.16-0.24均不会对测试结果产生明显响应，故本方法将样品称样量规定在0.16-0.24克。
参考文献
[1]王强，韩雅珊，戴蕴青，《色谱》（1997年11月 第15卷6期），反相高效液相色谱法同时测定番茄中5种类胡萝卜素
[2]卢红梅，梁逸曾，《色谱》（2005年1月 第23卷第1期），高效液相色谱法测定食品中的类胡萝卜素
[3]张志强，张英，《四川食品与酵》（2006年06期） 番茄红素的HPLC检测方法的研究
[4]丛浦珠，质谱学在天然有机化学中的应用 北京：科学出版社 1987.722
[5]王业勤，李勤生，天然类胡萝卜素---研究进展、生产、应用 北京：中国医药科技出版社，1997.1
关键词：正相高效液相色谱法、斑蝥黄 RSD 线性 回收率
斑蝥黄主要是作为一种着色剂，产品中顺反式虽然都有着色效果，但着色的效果有一定差异。在国内，10%斑蝥黄主要是用紫外分光光度法测定，对产品中顺反式比例也无明确的要求。在国外，对产品中杂质和顺反式都有较严格的要求。因此，根据市场要求建立了10%斑蝥黄的液相测试方法。
一、检测条件与方法
1.仪器和试剂
液相色谱仪WATERS 600-717-2996；超声水浴装置；氮气吹干装置；紫外可见分光光度计CARY100；玻璃仪器；正己烷（色谱纯）；丙酮（色谱纯）；氯仿（分析纯）；乙醇（分析纯）；BHT；斑蝥黄结晶（紫外测试含量为99.7%）；10%斑蝥黄。
2.方法
2.1对照溶液的制备
取0.03g的斑蝥黄结晶于100ml的容量瓶中，加入氯仿稀释到刻度，摇匀，为储备液。储备液可以在冰箱中避光保存2天。取1ml的储备液到50ml的容量瓶中，加入正己烷稀释到刻度，摇匀，为斑蝥黄结晶液相分析用对照溶液。取储备液1ml于100ml的容量瓶中，加入正己烷稀释到刻度，摇匀，为斑蝥黄结晶紫外含量测试溶液。紫外含量测试时，以正己烷为空白，在467nm处测试溶液的吸光度，并用下式计算斑蝥黄结晶的含量：
2.2样品溶液的制备
取0.2g的10%斑蝥黄样品（0.16-0.24g内）于250ml的容量瓶中，加入10ml的蒸馏水，0.5gBHT，在55℃的水浴中，超声处理5分钟，取出，加入氯仿100ml，乙醇100ml，摇匀，在常温水浴中超声处理5分中，取出后，加入氯仿稀释到刻度，摇匀。取该液5ml于50ml的容量瓶中，在氮气吹干装置上吹干，取出，加入氯仿2ml。超声溶解样品后，加入正己烷稀释到刻度，摇匀，为样品溶液。
2.3色谱条件
色谱柱：LiChrosorb Si60 250×4.0mm×4.6um
流动相：正己烷：丙酮=93：7
流速：1.5ml/min
检测波长：467nm
柱温：25℃
定量管：20ul
色谱稳定后，对照溶液及样品溶液在该色谱条件完成进样分析，得到相应的响应值，并利用外标法计算样品中斑蝥黄的含量。
2.4含量计算：
由于斑蝥黄中，顺式斑蝥黄和反式斑蝥黄均为有效含量，故峰面积F采用校正峰面积计算，计算方法为： （F斑蝥黄的校正峰面积，FE为反式斑蝥黄的峰面积，FZ为顺式斑蝥黄的峰面积，1.329顺反式校正因子）
其中：Fsample-为样品溶液中斑蝥黄的校正峰面积
mstandard-为斑蝥黄结晶的称样量，g
Cstandard-为斑蝥黄结晶的紫外含量，%
msample-为10%斑蝥黄样品称样量，g
Fstandard-为对照溶液中斑蝥黄的校正峰面积
2-为体积校正因子
二、结果与讨论
1.最佳波长选择
我首先用紫外分光光度计对斑蝥黄进行了扫描，扫描波长为400nm-540nm，结果可以看出其最大吸收峰在467nm。
2.流动相选择
我对不同流动相的不同配比进行了试验，最后选择正己烷：丙酮（93：7）作为本方法的流动相，在此条件下标准品和样品都有很好的分离度。
3.系统适应性图
分别取空白溶液、对照溶液按1.2.3规定色谱条件分别进样分析，得到色谱图，详见附图1 空白溶液色谱图 附图2 斑蝥黄结晶溶液色谱图。
从附图2中可以看出，E-Canthaxanthin和XZ-Canthaxanthin分离度达到了1.89，分离度符合测试要求，说明1.2.3色谱条件可以用于斑蝥黄测试。
4.线性测试
分别取对照溶液储备液0.2，0.6，1.0，1.4，1.8ml于50ml的容量瓶中，加入正己烷稀释到刻度，摇匀，在1.2.3色谱条件下完成进样分析。
5.精密度测试
测试方法：分别取约0.16g，0.20g，0.24g樣品各分三组按照1.2.2规定样品处理方法进行测试，次测试，样品的含量平均值为10.64%，RSD为0.90%，说明本文第一部分规定的液相测试方法测试斑蝥黄时具有良好的精密度，而且取样量从0.16-0.24均不会对测试结果产生明显响应。
6.回收率测试
数据分析：9次回收率平均值为：99.3%，可以看出该测试方法对10%益生红素测试回收率良好，能够满足正常测试要求。
三、结论
综上所述，10%斑蝥黄HPLC测试方法精密度好，回收率高，得到的测试结果准确可靠，是一种准确、快速、简便的分析方法。
根据2.5精度测试中可以看出取样量从0.16-0.24均不会对测试结果产生明显响应，故本方法将样品称样量规定在0.16-0.24克。
参考文献
[1]王强，韩雅珊，戴蕴青，《色谱》（1997年11月 第15卷6期），反相高效液相色谱法同时测定番茄中5种类胡萝卜素
[2]卢红梅，梁逸曾，《色谱》（2005年1月 第23卷第1期），高效液相色谱法测定食品中的类胡萝卜素
[3]张志强，张英，《四川食品与酵》（2006年06期） 番茄红素的HPLC检测方法的研究
[4]丛浦珠，质谱学在天然有机化学中的应用 北京：科学出版社 1987.722
[5]王业勤，李勤生，天然类胡萝卜素---研究进展、生产、应用 北京：中国医药科技出版社，1997.1