【摘 要】
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目的 构建马达蛋白KIF5B基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步构建稳定转染结直肠癌细胞模型,检测敲低KIF5B蛋白对结直肠癌细胞增殖的影响.方法 将PCR扩增的人KIF5B基因序列和设计合成的shRNA序列分别插入GV-358和GV-248表达载体.采用慢病毒三质粒包装系统共转染HEK293T细胞,进行病毒包装和扩增.重组慢病毒感染结直肠癌细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western blot法检测KIF5B过表达和沉默效率.CCK-8检测KIF5B干扰后HCT116和SW480细胞的增殖,
【机 构】
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100730 北京医院、国家老年医学中心、国家卫生健康委员会北京老年医学研究所、国家卫生健康委员会北京老年医学重点实验室、中国医学科学院老年医学研究院;100730 北京医院呼吸与危重症医学科;518
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目的 构建马达蛋白KIF5B基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步构建稳定转染结直肠癌细胞模型,检测敲低KIF5B蛋白对结直肠癌细胞增殖的影响.方法 将PCR扩增的人KIF5B基因序列和设计合成的shRNA序列分别插入GV-358和GV-248表达载体.采用慢病毒三质粒包装系统共转染HEK293T细胞,进行病毒包装和扩增.重组慢病毒感染结直肠癌细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western blot法检测KIF5B过表达和沉默效率.CCK-8检测KIF5B干扰后HCT116和SW480细胞的增殖,并检测细胞内周期相关蛋白的表达.结果 KIF5B过表达及shRNA载体测序与原设计序列完全符合.重组病毒感染结直肠癌细胞中,可见绿色荧光蛋白表达.KIF5B过表达组细胞中KIF5B-FLAG蛋白大量表达,KIF5B沉默细胞中,KIF5B的蛋白表达量显著下降.KIF5B被敲低后,HCT116和SW480细胞增殖加快,细胞内p21、p16两种蛋白表达下调.结论 成功建立了KIF5B过表达和沉默的结直肠癌细胞模型,并且发现KIF5B表达被干扰后,可能会抑制p21与p16蛋白的表达,加速细胞周期,从而促进结直肠癌细胞增殖.
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