【摘 要】
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SUMO蛋白酶（Ulp1）是切割小分子泛素修饰（SUMO）融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶,具有酶切效率高、特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵、操作复杂,限制了SUM
【机 构】
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江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室; 江南大学工业生物技术教育部重点实验室; 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室; 江南大学药学院;
【基金项目】
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国家863计划(2015AA020802)资助项目
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SUMO蛋白酶（Ulp1）是切割小分子泛素修饰（SUMO）融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶,具有酶切效率高、特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵、操作复杂,限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术,合成基因ulp1（Leu403-Lys621）,并在N端和C端加入多聚组氨酸标签（His6）,构建重组表达载体psv T7-ulp1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）和BL21 trx B（DE3）中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21（DE3）作为表达宿主,转接后7h加入IPTG,IPTG的终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为16h,最终蛋白质表达量占菌体总蛋白质量的34.5%,重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L,通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应,测定酶活为5.19U/μl,比酶活为5.23×104U/mg,是先前报道比酶活的1.87倍,通过酶活动力学分析,Ulp1的表观米氏常数Km=0.359g/L,Vm=5.10μg/（ml·min）。将SUMO融合表达体系用于单链抗体（single-chain antibody fragment,scFv）的表达,得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白,使用表达的Ulp1进行酶切并纯化,获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单,显著改善了scFv在大肠杆菌中难以高效可溶性表达纯化的现状。
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