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【摘 要】目的：观察大蒜素对痢疾杆菌的抑菌效果，初步探讨大蒜素的抑菌机制。方法：采用K-B纸片法、液体稀释法检测大蒜素对痢疾杆菌的抑菌效果及最小抑菌浓度（MIC）值；采用SDS-PAGE电泳法，观察大蒜素作用下菌体蛋白质电泳图谱的变化。结果：大蒜素对痢疾杆菌的抑菌环直径为15.3±1.676305mm，MIC值为100ug/ml，在SDS-PAGE中，大蒜素作用后，痢疾杆菌的蛋白图谱有变化。结论：大蒜素对痢疾杆菌有抑菌作用，并影响菌体蛋白质的合成，初步揭示了大蒜素的作用机制。
【关键词】大蒜素；SDS-PAGE；抑菌机制；痢疾杆菌
志贺菌属细菌通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性和危害严重的革兰阴性肠道致病菌，临床感染可导致细菌性痢疾（菌痢）。菌痢是世界上，尤其是发展中国家重要的传染病之一，全球每年的病例超过1.6亿，并导致100万患者死亡，其中绝大数为5岁以下的儿童[1]。目前，人们长期滥用抗生素造成了严重菌群失调和药物不良反应，因此，寻找一种不良反应少又有效的抗菌药物，是医学界努力的方向。大蒜为百合科植物，含有丰富的营养物质，又具有很高药用价值。原在法国、埃及等地早就用来佐餐、预防疫疠，秦汉时期传人我国，我国食用大蒜及用大蒜治疗疾病历史悠久，据《本草纲目》记载，大蒜有解毒散臃肿、消毒气、除风破冷、健脾治世等功效[2]。研究表明，大蒜抗菌的有效成分是大蒜素。本研究主要观察大蒜素对痢疾杆菌的抑菌作用，并对其抑菌机制进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1材料
大蒜素（江苏正大清江制药有限公司）；福氏痢疾杆菌（本室保存，菌号：51571-10）；营养琼脂培养基、MH琼脂培养基、MH肉汤培养基（北京奥博星责任股份有限公司）；过硫酸铵、冰醋酸（天津市百世化工有限公司）；TEMED、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、SDS、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250（艾勒科技有限公司）；甲醇（天津市科锐思精细化工有限公司）；蛋白Marker（北京鼎国盛生物技术有限责任公司）；滤纸
1.2仪器
电泳槽（北京六一仪器厂，型号DYCZ-24DN），电泳仪（北京六一仪器厂，型号DYY-6B型），摇床。
1.3方法
1.3.1大蒜素对痢疾杆菌的抑菌作用
1.3.1.1 菌悬液的制备
福氏痢疾志贺菌于营养琼脂培养基平板培养37℃ 18-24h，用无菌生理盐水将新鲜平板培养物洗下，以MH肉汤培养基制成浓度为1.6×106cfu/ml的菌悬液。
1.3.1.2 大蒜素液的制备
用MH肉汤培养基溶解大蒜素粉末，制成0.5mg/ml的大蒜素液，备用。
1.3.1.3 大蒜素药敏纸片的制备
将滤纸剪成直径为0.6cm的圆形纸片，121℃ 20mins高压灭菌冷却后，浸入上述大蒜素液中浸泡，备用[3]。
1.3.1.4 MH琼脂培养基制备
将MH琼脂培养基粉末加蒸馏水溶解后，121℃ 20mins高压灭菌，冷却至约50℃后注入120mm的玻璃培养皿中，待凝固后备用。
1.3.1.5 抑菌作用
取1ml上述浓度的菌悬液，涂布法均匀接种于MH琼脂培养皿中，将大蒜素药敏纸片贴于培养皿中心处，37℃培养24h后，测量抑菌圈的大小[4]。
1.3.2 测量大蒜素的最小抑菌浓度（MIC）
采用液体稀释法，制备含不同浓度的大蒜素MH肉汤培養液，然后向各浓度的肉汤中加入实验菌悬液并混匀，于37℃培养24h后，观察其是否有菌落生长，细菌不生长的最高稀释度为大蒜素的最低杀菌浓度。
1.3.3 SDS-PAGE电泳试验
配制10%的聚丙烯酰胺凝胶[5]，将1.3.2中含大蒜素的菌体及空白对照与等体积上样缓冲液混合后，经沸水浴5mins，与10000r/min离心1min，取上清上样，每孔30μl，进行电泳。然后用考马斯亮蓝染色液染色3h，再脱色，观察结果。
2 结果
2.1 表1 大蒜素对福氏痢疾志贺菌的抑菌情况
3结论
3.1大蒜素对痢疾杆菌的抑菌作用
用K-B法初步检测大蒜素对痢疾杆菌是否有作用，从表1中可以看出大蒜素对痢疾杆菌有一定的抑菌作用，其抑菌环直径为15.3±1.676305mm。
3.2测量大蒜素的最小抑菌浓度（MIC）
用液体稀释法检测大蒜素对痢疾杆菌的最小抑菌浓度应该为100ug/ml
3.3对最小抑菌浓度的培养物和没有加药的阴性对照进行的SDS-PAGE可以看出在2-105kD中间有几条蛋白条带有缺失或者降低的情况，说明药物可能作用于该位置上，从而干扰细菌的增殖。
4讨论
目前，关于菌痢的确切发病机制尚未明确，国外学者研究认为，痢疾杆菌的感染可能包括以下过程[6-8]：1、痢疾杆菌通过微皱褶细胞进入结肠粘膜，Sansonetti等[9]发现具黏附性而无侵袭性的痢疾杆菌变异株BS15感染后，M细胞伸展似一大口袋装，其内含有大量的单核细胞；2、定植的巨噬细胞吞噬痢疾杆菌后发生凋亡，释放炎症因子，Hilbil等[10]发现LPS与IFN-γ可阻止痢疾杆菌诱导的巨噬细胞凋亡，其机制不清，可能与LPS与IFN-γ激活巨噬细胞、增强其杀菌活性有关；3、痢疾杆菌侵袭临近的上皮细胞，在其内增殖、扩散及导致年末损伤。
细菌对抗菌药物的耐药性是自然界的抗生现象，其主要通过4种方法产生耐药性：1、产生灭活酶或钝化酶，使抗菌药物失活或结构改变；2、
抗菌药物作用导致靶位改变或数目改变，使之不与抗菌药物结合；3、改变细菌细胞壁的通透性，使抗菌药物不能进入菌体内；4、通过主动排外作用，将药物排出菌体之外[11]。大蒜素是一种天然广谱抗生素，其作用机制是抑制细胞内巯基酶的活性，影响细菌的代谢，破坏其生长繁殖[12]。 本实验首先用K-B法发现大蒜素对痢疾杆菌有抑菌作用，然后又采用液体稀释法检测出大蒜素对痢疾杆菌的MIC值。初步探讨了大蒜素对痢疾桿菌有抑菌作用。
自20世纪90年代首次提出“蛋白质组”概念以来，蛋白质组学技术得到快速发展。“蛋白质组”研究是对基因组研究的重要补充，它能在蛋白质水平定量、动态、整体性研究生物体，是生命活动机制的分析工具。本实验分析了在大蒜素作用前后，痢疾杆菌蛋白质图谱的改变，我们初步发现有6-7个部位的蛋白发生了变化比较明显，为进一步大蒜素对痢疾杆菌的作用机制，以及痢疾杆菌致病的分子机制研究奠定了基础。
参考文献：
[1] Sansonetti PJ. Microbes and microbial toxins[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，280（3）：G319-G323.
[2] 李时珍. 本草纲目[J].北京：人民卫生出版社，1997.
[3] 田玉成. 精制大蒜杀菌效果的研究[J].实用预防医学，1999，6：1.
[4] 管远志，王艾琳，李坚.医学微生物学实验技术[M].北京：化学工业出版社，2005：109-114
[5] 卢圣栋. 现代分子生物学技术[M].北京：中国协和医科大学出版社，2001：352-356.
[6] Hathaway LJ， Griffin GE， Sansonetti PJ， et al. Human monocytes kill Shigella flexneri but then die by apoptosis associated with suppression of proinflam-matory cytokine production[J]. Infect Immun， 2002，70（7）：3882-3842.
[7] Zychlinsky A， Thirumalai K， Arondel J， et al. In vivo apoptosis in Shigella flexneri infections[J]. Infect Immun， 1996，64（12）：5357-5365.
[8] Sansonetti PJ， Tran Van， Nhieu G， Egile C. Rupture of the intestinal epithelial barrier and mucosal invasion by Shigella flexneri[J]. Clin Infect Dis， 1999，28（3）：466-475.
[9] Sansonetti PJ， Arondel J， Cantey JR， et al. Infection of rabbit Peyer’s patches by Shigella flexneri： Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium [J]. Infect Immun， 1996， 64（7） ：2752-2764.
[10] Hilbi H， Chen Y， Thirumalai K， et al. The interleukin 1β-converting enzyme， caspase-1，is activated during Shigella flexneri-induced apoptosis in human monocyte-derived macrophages[J]. Infect Immun，1997，65（12）：5165-5170.
[11] 王睿，柴栋.细菌耐药机制与临床治疗对策[J]. 国外医药抗生素分册，2003，24（3）：97
[12] 严常开，曾繁典 大蒜的主要化学成分及其药理作用研究进展[J] 中国新药杂志，2004，13：8
【关键词】大蒜素；SDS-PAGE；抑菌机制；痢疾杆菌
志贺菌属细菌通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性和危害严重的革兰阴性肠道致病菌，临床感染可导致细菌性痢疾（菌痢）。菌痢是世界上，尤其是发展中国家重要的传染病之一，全球每年的病例超过1.6亿，并导致100万患者死亡，其中绝大数为5岁以下的儿童[1]。目前，人们长期滥用抗生素造成了严重菌群失调和药物不良反应，因此，寻找一种不良反应少又有效的抗菌药物，是医学界努力的方向。大蒜为百合科植物，含有丰富的营养物质，又具有很高药用价值。原在法国、埃及等地早就用来佐餐、预防疫疠，秦汉时期传人我国，我国食用大蒜及用大蒜治疗疾病历史悠久，据《本草纲目》记载，大蒜有解毒散臃肿、消毒气、除风破冷、健脾治世等功效[2]。研究表明，大蒜抗菌的有效成分是大蒜素。本研究主要观察大蒜素对痢疾杆菌的抑菌作用，并对其抑菌机制进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1材料
大蒜素（江苏正大清江制药有限公司）；福氏痢疾杆菌（本室保存，菌号：51571-10）；营养琼脂培养基、MH琼脂培养基、MH肉汤培养基（北京奥博星责任股份有限公司）；过硫酸铵、冰醋酸（天津市百世化工有限公司）；TEMED、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、SDS、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250（艾勒科技有限公司）；甲醇（天津市科锐思精细化工有限公司）；蛋白Marker（北京鼎国盛生物技术有限责任公司）；滤纸
1.2仪器
电泳槽（北京六一仪器厂，型号DYCZ-24DN），电泳仪（北京六一仪器厂，型号DYY-6B型），摇床。
1.3方法
1.3.1大蒜素对痢疾杆菌的抑菌作用
1.3.1.1 菌悬液的制备
福氏痢疾志贺菌于营养琼脂培养基平板培养37℃ 18-24h，用无菌生理盐水将新鲜平板培养物洗下，以MH肉汤培养基制成浓度为1.6×106cfu/ml的菌悬液。
1.3.1.2 大蒜素液的制备
用MH肉汤培养基溶解大蒜素粉末，制成0.5mg/ml的大蒜素液，备用。
1.3.1.3 大蒜素药敏纸片的制备
将滤纸剪成直径为0.6cm的圆形纸片，121℃ 20mins高压灭菌冷却后，浸入上述大蒜素液中浸泡，备用[3]。
1.3.1.4 MH琼脂培养基制备
将MH琼脂培养基粉末加蒸馏水溶解后，121℃ 20mins高压灭菌，冷却至约50℃后注入120mm的玻璃培养皿中，待凝固后备用。
1.3.1.5 抑菌作用
取1ml上述浓度的菌悬液，涂布法均匀接种于MH琼脂培养皿中，将大蒜素药敏纸片贴于培养皿中心处，37℃培养24h后，测量抑菌圈的大小[4]。
1.3.2 测量大蒜素的最小抑菌浓度（MIC）
采用液体稀释法，制备含不同浓度的大蒜素MH肉汤培養液，然后向各浓度的肉汤中加入实验菌悬液并混匀，于37℃培养24h后，观察其是否有菌落生长，细菌不生长的最高稀释度为大蒜素的最低杀菌浓度。
1.3.3 SDS-PAGE电泳试验
配制10%的聚丙烯酰胺凝胶[5]，将1.3.2中含大蒜素的菌体及空白对照与等体积上样缓冲液混合后，经沸水浴5mins，与10000r/min离心1min，取上清上样，每孔30μl，进行电泳。然后用考马斯亮蓝染色液染色3h，再脱色，观察结果。
2 结果
2.1 表1 大蒜素对福氏痢疾志贺菌的抑菌情况
3结论
3.1大蒜素对痢疾杆菌的抑菌作用
用K-B法初步检测大蒜素对痢疾杆菌是否有作用，从表1中可以看出大蒜素对痢疾杆菌有一定的抑菌作用，其抑菌环直径为15.3±1.676305mm。
3.2测量大蒜素的最小抑菌浓度（MIC）
用液体稀释法检测大蒜素对痢疾杆菌的最小抑菌浓度应该为100ug/ml
3.3对最小抑菌浓度的培养物和没有加药的阴性对照进行的SDS-PAGE可以看出在2-105kD中间有几条蛋白条带有缺失或者降低的情况，说明药物可能作用于该位置上，从而干扰细菌的增殖。
4讨论
目前，关于菌痢的确切发病机制尚未明确，国外学者研究认为，痢疾杆菌的感染可能包括以下过程[6-8]：1、痢疾杆菌通过微皱褶细胞进入结肠粘膜，Sansonetti等[9]发现具黏附性而无侵袭性的痢疾杆菌变异株BS15感染后，M细胞伸展似一大口袋装，其内含有大量的单核细胞；2、定植的巨噬细胞吞噬痢疾杆菌后发生凋亡，释放炎症因子，Hilbil等[10]发现LPS与IFN-γ可阻止痢疾杆菌诱导的巨噬细胞凋亡，其机制不清，可能与LPS与IFN-γ激活巨噬细胞、增强其杀菌活性有关；3、痢疾杆菌侵袭临近的上皮细胞，在其内增殖、扩散及导致年末损伤。
细菌对抗菌药物的耐药性是自然界的抗生现象，其主要通过4种方法产生耐药性：1、产生灭活酶或钝化酶，使抗菌药物失活或结构改变；2、
抗菌药物作用导致靶位改变或数目改变，使之不与抗菌药物结合；3、改变细菌细胞壁的通透性，使抗菌药物不能进入菌体内；4、通过主动排外作用，将药物排出菌体之外[11]。大蒜素是一种天然广谱抗生素，其作用机制是抑制细胞内巯基酶的活性，影响细菌的代谢，破坏其生长繁殖[12]。 本实验首先用K-B法发现大蒜素对痢疾杆菌有抑菌作用，然后又采用液体稀释法检测出大蒜素对痢疾杆菌的MIC值。初步探讨了大蒜素对痢疾桿菌有抑菌作用。
自20世纪90年代首次提出“蛋白质组”概念以来，蛋白质组学技术得到快速发展。“蛋白质组”研究是对基因组研究的重要补充，它能在蛋白质水平定量、动态、整体性研究生物体，是生命活动机制的分析工具。本实验分析了在大蒜素作用前后，痢疾杆菌蛋白质图谱的改变，我们初步发现有6-7个部位的蛋白发生了变化比较明显，为进一步大蒜素对痢疾杆菌的作用机制，以及痢疾杆菌致病的分子机制研究奠定了基础。
参考文献：
[1] Sansonetti PJ. Microbes and microbial toxins[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，280（3）：G319-G323.
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[7] Zychlinsky A， Thirumalai K， Arondel J， et al. In vivo apoptosis in Shigella flexneri infections[J]. Infect Immun， 1996，64（12）：5357-5365.
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[9] Sansonetti PJ， Arondel J， Cantey JR， et al. Infection of rabbit Peyer’s patches by Shigella flexneri： Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium [J]. Infect Immun， 1996， 64（7） ：2752-2764.
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[11] 王睿，柴栋.细菌耐药机制与临床治疗对策[J]. 国外医药抗生素分册，2003，24（3）：97
[12] 严常开，曾繁典 大蒜的主要化学成分及其药理作用研究进展[J] 中国新药杂志，2004，13：8