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摘要：目的：探讨有氧训练对大鼠骨骼肌ChREBP及其调节因子PP2A、PKA、AMPK和MLx的影响。方法：20只适应训练后8周龄SD大鼠随机分为安静组和运动组，每组10只。运动组进行35 m/min、1 h /d、5d/周跑台训练、共训练4周。RQ-PCR和WB检测PP2A、PKA、AMPK、MLx和ChREBP的基因和蛋白表达。结果：经过4周有氧训练后，运动组大鼠腓肠肌PP2A、AMPK mRNA表达和AMPK、MLx蛋白表达水平显著高于安静组（P<001或P < 005），PP2A和 CHREBP蛋白表达水平显著降低（P<001），其余指标间无显著变化（P>005）。结论：有氧训练通过降低CHREBP蛋白表达和通过PP2A、PKA、AMPK途径降低CHREBP活性抑制ChREBP功能，可能是有氧训练降低体脂的机制之一。
关键词：有氧训练；ChREBP；PP2A；AMPK；PKA；MLx
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2013）05-0036-04
糖类应答元件结合蛋白（carbohydrate response element binding protein，ChREBP）是2001年发现的一种能与糖类应答元件（carbohydrate response element，ChRE）结合的蛋白质，在哺乳动物的各种组织器官中分布广泛，而以肝脏、脂肪、小肠、肾脏和肌肉等组织中含量较多[1]。有研究显示，肝脏中有139个基因受 ChREBP 的调节，包括与糖代谢有关的丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等，与脂肪酸合成有关的脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶等，与甘油三酯合成有关的线粒体甘油三酯转移蛋白、三磷酸甘油脱氢酶等[2]。目前大量的研究表明，ChREBP是独立于胰岛素之外的调控糖脂代谢的重要转录因子，在机体能量代谢中起到非常重要的转录调节作用。有氧训练是目前治疗肥胖及其相关的糖尿病、脂肪肝等病症的有效手段，涉及的研究目前多与胰岛素有关，而ChREBP在其中的影响及相关机制却鲜有报道。本研究通过观察有氧训练对大鼠骨骼肌中ChREBP及其调节因子蛋白磷酸酶2A （protein phosphatase 2A，PP2A）、蛋白激酶A （protein kinase A，PKA）、AMP活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）和Max 样蛋白 X（Max like protein x，MLx）基因和蛋白表达的影响，为有氧训练改善机体糖脂代谢的机制研究提供新的实验依据。
1材料与方法
1.1动物与分组
6周龄雄性SD大鼠30只，购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2009-0002，体重160～180 g，分笼饲养，每笼5只，自由饮食，室温23℃～25℃，湿度40%～60%，自然光照，自由饮食。定期消毒饲养室、用具等。所有大鼠在常氧条件下先进行2周跑台适应性训练，每天运动15 min，速度从12 m/min开始，逐天增加，2周后达到35 m/min。动物跑台为杭州段氏大鼠跑台。两周后根据大鼠体重和训练情况进行正态分布分组，淘汰体重过重和过轻、运动能力较差及有伤病的大鼠，保留20只进行正式实验。20只大鼠随机分为安静组和运动组，每组10只。本实验在广州体育学院运动生物化学重点实验室进行。
1.2训练方案
训练组进行常氧环境下的跑台训练，35 m/min、1 h /d、5 d/周[3]。安静组正常生活，不接受跑台训练，正式实验时间为4周。
1.3标品采集
第4周末，运动组完成最后训练24 h后取材，安静组同一时间取材。按0.3 ml/100g体重剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，迅速分离腓肠肌，以灭菌锡纸包好在液氮中快速冷冻后保存于-80℃超低温冰箱中。
1.4测试方法
1.4.1RQ-PCR测定 PP2A、MLx和ChREBP基因表达
总RNA提取：以Trizol Reagent （Invitrogen，USA）提取腓肠肌总 RNA，经紫外分光光度仪测定其OD260/OD280在1.6～1.8之间，提示提取的RNA符合纯度要求，可用于后续PCR。
反转录合成模板cDNA：0.5ml去酶管中加入总RNA 2 μg、25×Oligo dT 1 μl 、 加DEPC-去离子水至 13 μl ；850C 变性5 min，然后冰上放置2 min以上；加入逆转录5×反应缓冲液5 μl，25mM dNTP 1 μl 、25 U/μl RNase Inhibitor 1 μl、M-MLV RTase（RNase H free）（GeneCopoeia，USA）1 μl、ddH2O（RNase/DNase free）4 μl，总体积为25 μl。混匀配制的反应mix，短暂离心后在42℃反应60 min， 再进行85℃ 5min 灭活处理。所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。
引物设计：从NCBI中查寻目标基因序列，由TAKARA公司设计和合成目标基因引物。PP2A（sense：5’ TGG ACC AGT GGA TCG AGC AG 3’，antisense：5’ ATG CAC ATC TCC ACA CAC AGT GAC 3’），PKA（sense：5’ AAG CTG AAG CAG ATC GAG CAC A 3’，antisense：5’ CAG GCA CGT ACT CCA TGA CCA 3’），AMPK（sense：5’ CAG GCA CAT GGT TGT CCA CAG 3’，antisense：5’ AAT TTG GCG ATC CAC AGC TAG TTC 3’），MLx（sense：5’ TCC AGA GCT AAT AGC ATC GGT TC 3’，antisense：5’ GAC AAT GGT CTG AAG GTC ATC ATA G 3’），ChREBP（sense：5’GGT TGT CCC CAA AGC AGA GAG3’，antisense：5’GGA GAC AGG TGG ACA CTC AGT3’），GAPDH（sense：5’TGG TCT ACA TGT TCC AGT ATG ACT3’，antisense：5’CCA TTT GAT GTT AGC GGG ATC TC3’）。 RQ-PCR：取0.2 μl薄壁PCR管加入2×AllinOneTM Q-PCR Mix（GeneCopoeia，USA）10 μl、ddH2O 4 μl、PCR上游引物 2 μl、PCR下游引物2 μl、模板2 μl，总体积20 μl。混匀置于Bio-Rad Q-PCR仪（BIO-RAD，USA）中。95℃10 min预变性后，变性95℃10 s，退火54 ℃～60 ℃ 20 s，延伸72℃ 15 s，40个循环。测出Ct值并进行溶解曲线分析，以GAPDH为内参，用比较Ct值法计算相对表达量：△△Ct=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct 值）-（对照组目的基因Ct 值-对照组内参基因Ct 值），相对表达量F=2-△△Ct。
1.4.2WB测定PP2A、MLx和ChREBP蛋白表达
总蛋白提取：以凯基全蛋白提取试剂盒（KGP2100） 提取腓肠肌总蛋白，用Bradford法蛋白定量后，将样品调节成5 μg/μl分装保存于-20℃。
Western blotting：取出蛋白质样品加入上样缓冲液混匀，95℃煮5 min，各样品等量上样。根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶（8%～10%）和浓缩胶（5%）进行电泳，湿式恒压电转至NC膜。室温封闭后加入兔来源一抗PP2A（SAB）、PKA（BioVision）、AMPK（Cell）、MLx（SANTA）、ChREBP（SANTA）孵育60 min，洗涤后加入荧光二抗（Li-Cor）室温避光孵育30～60 min，PBS冲洗后以Odyssey近红外双色激光成像系统进行扫描和分析。
1.5数据统计
实验数据用平均值±标准差表示，以SPSS14.0统计学软件包进行t检验，显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。
2实验结果
由表1可见，经过4周有氧训练后，运动组大鼠腓肠肌PP2A 和AMPK mRNA表达显著高于安静组（P<0.01），而PKA、MLx和 CHREBP mRNA表达在两组间无显著差别（P>0.05）。
由表2可见， 相对安静组，4周有氧训练显著提高运动组大鼠腓肠肌AMPK和MLx蛋白表达水平（P<0.05和P<0.01），却显著降低PP2A和 CHREBP表达水平（P<0.01），PKA则无显著差异（P>0.05）。
3讨论
ChREBP是首先在大鼠肝脏中发现的一种大分子蛋白，随后在多种哺乳动物的组织中均有检测到。ChREBP分子量为9.46 kDa，包含有864个氨基酸，其氨基酸链主要分为四个功能区，即位于N端的负责核定位信号的核定位区（Nuclear Localization Signal，NLS）、位于中间的富脯氨酸区（Pro-rich）以及位于C端的类亮氨酸拉链区（Zip-like）和负责DNA结合的碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链区（basic Helix-Loop-Helix/Leucine Zipper， bHLH/LZ）[4]。
磷酸化和去磷酸化是影响ChREBP功能的主要方式，因此其氨基酸链上的四个磷酸化位点尤为重要。PP2A将Ser196的磷酸化位点去磷酸化后，ChREBP从细胞质转运到细胞核，而PKA将Ser196的磷酸化位点磷酸化后，ChREBP则留滞在细胞质无法进入细胞核。在细胞质中磷酸化的Thr666进入细胞核中需要在PP2A的去磷酸化作用后才能使ChREBP产生DNA结合活性，而同样被PKA和PP2A调控着磷酸化和去磷酸化的Ser626以及被AMPK磷酸化调控的Ser568也在调节ChREBP的DNA结合活性上发挥作用，其中Ser568的磷酸化也能导致ChREBP失去DNA结合活性，而Ser626可能仅仅起到了附属的辅助作用[1，5]。总之，Ser196位点的去磷酸化使ChREBP从细胞质转运到细胞核，Ser626、Thr666和Ser568位点的去磷酸化活化ChREBP的DNA结合活性，从而使ChREBP能与靶基因的ChRE序列结合，调节靶基因的转录过程。
本研究显示，经过4周有氧训练后，运动组大鼠腓肠肌PP2A mRNA表达显著高于安静组，而蛋白表达却显著下降，提示有氧训练对PP2A的影响在基因和蛋白层次存在差异。PP2A是异源三聚体，由α结构亚基、β调节亚基和γ催化亚基组成，是丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶调节细胞内的多种磷酸化机制，涉及细胞代谢、细胞周期、细胞凋亡、信号转导、基因表达和翻译等过程，在细胞内的表达受到严密调控，其表达水平相对恒定，但在某些情况下全反式维甲酸、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、游离的ATP和焦磷酸盐等可以使PP2A表达发生改变[6]，针灸和艾灸也能上调PP2A的活性及表达[7-8]，但其调节机制仍需进一步研究。
PKA的分子是由2个调节亚基和2个催化亚基构成的异四聚体。当cAMP不存在时，PKA以无活性的全酶状态存在；当PKA的调节亚基与cAMP结合时，导致调节亚基的构象改变而与催化亚基解离，产生2个激活的催化亚基单体。激活的PKA催化亚基通过对靶基因调节蛋白的磷酸化作用，进而影响到基因的表达或翻译，诱导细胞的应激反应。众多研究表明，运动对心脏、肝脏、血液、大脑海马等不同组织cAMP浓度有一定的影响[9]。侯伊玲等[10]在实验中发现大鼠急性心肌梗死后有氧训练8周，心肌cAMP 含量及PKA蛋白表达水平显著高于假手术组，通过有关信号途径改善心室功能。本研究显示运动使腓肠肌PKA mRNA和蛋白表达分别升高了15.5%和50.0%，但无显著性意义。
AMPK是一个异三聚体，由α催化亚基和β、γ调节亚基构成。AMPK是维持细胞能量代谢平衡的重要因子，激活AMPK的关键因素是ATP的下降和AMP的上升，AMP通过不同途径直接或间接激活AMPK，AMPK通过对下游相关能量代谢的靶蛋白的调节促进葡萄糖和脂肪酸的分解代谢和增加ATP含量同时降低糖原、甘油三酯和胆固醇的合成代谢、减少ATP的消耗，在葡萄糖、脂肪和胆固醇的代谢中具有重要作用。研究表明，运动对AMPK的激活由于强度、时间的不同，各个亚基的激活程度有所区别，而长时间的运动可使AMPK三个亚基的表达均有所上调，并且AMPK的活性亦随之上升[11]。而有的研究目前还存分歧，如在运动对骨骼肌中AMPKα1的诱导效应中升高、降低和无变化的结果均有报道[12]。本研究显示，四周的有氧训练显著升高大鼠腓肠肌AMPK mRNA和蛋白表达水平。 Mlx属于转录因子bHLH/ZIP家族的成员之一，分为α、β、γ三种亚型，组成Mlx环的氨基酸残基中的疏水性残基通过疏水键与ChREBP相结合，必须在Mlx存在的环境下，ChREBP才能与含有ChoRE的低聚核苷酸结合[13]。研究表明，显性抑制肝细胞Mlx，则使糖脂代谢的丙酮酸激酶、脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶等也完全受到抑制[14]。因此，Mlx是ChREBP在糖脂代谢中的重要功能性调节因子。本研究显示，运动组大鼠腓肠肌Mlx mRNA表达与安静组无显著差别，蛋白表达显著升高，提示有氧训练对大鼠骨骼肌Mlx的影响主要也是诱导蛋白表达。
本实验结果显示，运动组大鼠腓肠肌ChREBP mRNA表达水平与安静组无明显差异，提示有氧训练对骨骼肌ChREBP基因表达影响不大，这与我们早期研究[15]中发现的有氧训练对正常大鼠肝脏ChREBP基因表达影响结果相类似。但我们以往也发现有氧训练能使高糖高脂诱导的肝脏ChREBP基因过表达显著下降[16]，提示ChREBP在机体的表达具有良好的平衡调节机制，能根据机体的不同状态适当调节以适应机体生理机能的需要。运动组大鼠腓肠肌ChREBP蛋白表达水平显著低于安静组，提示有氧训练显著降低ChREBP蛋白含量。Iizuka等[1]在实验中发现，ChREBP基因敲除小鼠肝脏中参与脂肪酸合成的酶，包括脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶等、ATP-柠檬酸裂解酶和脂酰CoA去饱和酶1等的基因表达水平均较对照小鼠明显降低，导致肝脏脂肪酸合成率下降，体内脂肪组织含量显著降低。因此有氧训练降低ChREBP蛋白表达可能也是有氧运动降低体内脂肪含量的原因之一。有氧训练对ChREBP与Mlx蛋白表达影响不一致，提示它们各自可能存在其它的调节机制，具体仍需进一步研究。
本研究通过对影响ChREBP功能相关因子的观察显示，有氧训练降低使ChREBP去磷酸化的PP2A蛋白表达水平，同时升高使ChREBP磷酸化的PKA和AMPK蛋白表达水平，不利于ChREBP从细胞质转运到细胞核及ChREBP的DNA结合活性，使ChREBP的功能受到抑制，虽然MLx蛋白含量升高，但由于ChREBP本身蛋白和活性水平受到抑制，因此可能导致了其下游包括脂肪合成在内的相关靶基因转录水平的下调，进一步解释了有氧训练降低体脂的可能机制之一。
4总结
有氧训练一方面降低ChREBP蛋白表达水平，另一方面降低PP2A和升高PKA、AMPK蛋白表达水平，不利于ChREBP的转运及DNA结合活性，使ChREBP功能受到抑制，可能是有氧训练降低体脂的机制之一。
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关键词：有氧训练；ChREBP；PP2A；AMPK；PKA；MLx
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2013）05-0036-04
糖类应答元件结合蛋白（carbohydrate response element binding protein，ChREBP）是2001年发现的一种能与糖类应答元件（carbohydrate response element，ChRE）结合的蛋白质，在哺乳动物的各种组织器官中分布广泛，而以肝脏、脂肪、小肠、肾脏和肌肉等组织中含量较多[1]。有研究显示，肝脏中有139个基因受 ChREBP 的调节，包括与糖代谢有关的丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等，与脂肪酸合成有关的脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶等，与甘油三酯合成有关的线粒体甘油三酯转移蛋白、三磷酸甘油脱氢酶等[2]。目前大量的研究表明，ChREBP是独立于胰岛素之外的调控糖脂代谢的重要转录因子，在机体能量代谢中起到非常重要的转录调节作用。有氧训练是目前治疗肥胖及其相关的糖尿病、脂肪肝等病症的有效手段，涉及的研究目前多与胰岛素有关，而ChREBP在其中的影响及相关机制却鲜有报道。本研究通过观察有氧训练对大鼠骨骼肌中ChREBP及其调节因子蛋白磷酸酶2A （protein phosphatase 2A，PP2A）、蛋白激酶A （protein kinase A，PKA）、AMP活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）和Max 样蛋白 X（Max like protein x，MLx）基因和蛋白表达的影响，为有氧训练改善机体糖脂代谢的机制研究提供新的实验依据。
1材料与方法
1.1动物与分组
6周龄雄性SD大鼠30只，购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2009-0002，体重160～180 g，分笼饲养，每笼5只，自由饮食，室温23℃～25℃，湿度40%～60%，自然光照，自由饮食。定期消毒饲养室、用具等。所有大鼠在常氧条件下先进行2周跑台适应性训练，每天运动15 min，速度从12 m/min开始，逐天增加，2周后达到35 m/min。动物跑台为杭州段氏大鼠跑台。两周后根据大鼠体重和训练情况进行正态分布分组，淘汰体重过重和过轻、运动能力较差及有伤病的大鼠，保留20只进行正式实验。20只大鼠随机分为安静组和运动组，每组10只。本实验在广州体育学院运动生物化学重点实验室进行。
1.2训练方案
训练组进行常氧环境下的跑台训练，35 m/min、1 h /d、5 d/周[3]。安静组正常生活，不接受跑台训练，正式实验时间为4周。
1.3标品采集
第4周末，运动组完成最后训练24 h后取材，安静组同一时间取材。按0.3 ml/100g体重剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，迅速分离腓肠肌，以灭菌锡纸包好在液氮中快速冷冻后保存于-80℃超低温冰箱中。
1.4测试方法
1.4.1RQ-PCR测定 PP2A、MLx和ChREBP基因表达
总RNA提取：以Trizol Reagent （Invitrogen，USA）提取腓肠肌总 RNA，经紫外分光光度仪测定其OD260/OD280在1.6～1.8之间，提示提取的RNA符合纯度要求，可用于后续PCR。
反转录合成模板cDNA：0.5ml去酶管中加入总RNA 2 μg、25×Oligo dT 1 μl 、 加DEPC-去离子水至 13 μl ；850C 变性5 min，然后冰上放置2 min以上；加入逆转录5×反应缓冲液5 μl，25mM dNTP 1 μl 、25 U/μl RNase Inhibitor 1 μl、M-MLV RTase（RNase H free）（GeneCopoeia，USA）1 μl、ddH2O（RNase/DNase free）4 μl，总体积为25 μl。混匀配制的反应mix，短暂离心后在42℃反应60 min， 再进行85℃ 5min 灭活处理。所得的单链cDNA 放置于-20℃保存。
引物设计：从NCBI中查寻目标基因序列，由TAKARA公司设计和合成目标基因引物。PP2A（sense：5’ TGG ACC AGT GGA TCG AGC AG 3’，antisense：5’ ATG CAC ATC TCC ACA CAC AGT GAC 3’），PKA（sense：5’ AAG CTG AAG CAG ATC GAG CAC A 3’，antisense：5’ CAG GCA CGT ACT CCA TGA CCA 3’），AMPK（sense：5’ CAG GCA CAT GGT TGT CCA CAG 3’，antisense：5’ AAT TTG GCG ATC CAC AGC TAG TTC 3’），MLx（sense：5’ TCC AGA GCT AAT AGC ATC GGT TC 3’，antisense：5’ GAC AAT GGT CTG AAG GTC ATC ATA G 3’），ChREBP（sense：5’GGT TGT CCC CAA AGC AGA GAG3’，antisense：5’GGA GAC AGG TGG ACA CTC AGT3’），GAPDH（sense：5’TGG TCT ACA TGT TCC AGT ATG ACT3’，antisense：5’CCA TTT GAT GTT AGC GGG ATC TC3’）。 RQ-PCR：取0.2 μl薄壁PCR管加入2×AllinOneTM Q-PCR Mix（GeneCopoeia，USA）10 μl、ddH2O 4 μl、PCR上游引物 2 μl、PCR下游引物2 μl、模板2 μl，总体积20 μl。混匀置于Bio-Rad Q-PCR仪（BIO-RAD，USA）中。95℃10 min预变性后，变性95℃10 s，退火54 ℃～60 ℃ 20 s，延伸72℃ 15 s，40个循环。测出Ct值并进行溶解曲线分析，以GAPDH为内参，用比较Ct值法计算相对表达量：△△Ct=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct 值）-（对照组目的基因Ct 值-对照组内参基因Ct 值），相对表达量F=2-△△Ct。
1.4.2WB测定PP2A、MLx和ChREBP蛋白表达
总蛋白提取：以凯基全蛋白提取试剂盒（KGP2100） 提取腓肠肌总蛋白，用Bradford法蛋白定量后，将样品调节成5 μg/μl分装保存于-20℃。
Western blotting：取出蛋白质样品加入上样缓冲液混匀，95℃煮5 min，各样品等量上样。根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶（8%～10%）和浓缩胶（5%）进行电泳，湿式恒压电转至NC膜。室温封闭后加入兔来源一抗PP2A（SAB）、PKA（BioVision）、AMPK（Cell）、MLx（SANTA）、ChREBP（SANTA）孵育60 min，洗涤后加入荧光二抗（Li-Cor）室温避光孵育30～60 min，PBS冲洗后以Odyssey近红外双色激光成像系统进行扫描和分析。
1.5数据统计
实验数据用平均值±标准差表示，以SPSS14.0统计学软件包进行t检验，显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。
2实验结果
由表1可见，经过4周有氧训练后，运动组大鼠腓肠肌PP2A 和AMPK mRNA表达显著高于安静组（P<0.01），而PKA、MLx和 CHREBP mRNA表达在两组间无显著差别（P>0.05）。
由表2可见， 相对安静组，4周有氧训练显著提高运动组大鼠腓肠肌AMPK和MLx蛋白表达水平（P<0.05和P<0.01），却显著降低PP2A和 CHREBP表达水平（P<0.01），PKA则无显著差异（P>0.05）。
3讨论
ChREBP是首先在大鼠肝脏中发现的一种大分子蛋白，随后在多种哺乳动物的组织中均有检测到。ChREBP分子量为9.46 kDa，包含有864个氨基酸，其氨基酸链主要分为四个功能区，即位于N端的负责核定位信号的核定位区（Nuclear Localization Signal，NLS）、位于中间的富脯氨酸区（Pro-rich）以及位于C端的类亮氨酸拉链区（Zip-like）和负责DNA结合的碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链区（basic Helix-Loop-Helix/Leucine Zipper， bHLH/LZ）[4]。
磷酸化和去磷酸化是影响ChREBP功能的主要方式，因此其氨基酸链上的四个磷酸化位点尤为重要。PP2A将Ser196的磷酸化位点去磷酸化后，ChREBP从细胞质转运到细胞核，而PKA将Ser196的磷酸化位点磷酸化后，ChREBP则留滞在细胞质无法进入细胞核。在细胞质中磷酸化的Thr666进入细胞核中需要在PP2A的去磷酸化作用后才能使ChREBP产生DNA结合活性，而同样被PKA和PP2A调控着磷酸化和去磷酸化的Ser626以及被AMPK磷酸化调控的Ser568也在调节ChREBP的DNA结合活性上发挥作用，其中Ser568的磷酸化也能导致ChREBP失去DNA结合活性，而Ser626可能仅仅起到了附属的辅助作用[1，5]。总之，Ser196位点的去磷酸化使ChREBP从细胞质转运到细胞核，Ser626、Thr666和Ser568位点的去磷酸化活化ChREBP的DNA结合活性，从而使ChREBP能与靶基因的ChRE序列结合，调节靶基因的转录过程。
本研究显示，经过4周有氧训练后，运动组大鼠腓肠肌PP2A mRNA表达显著高于安静组，而蛋白表达却显著下降，提示有氧训练对PP2A的影响在基因和蛋白层次存在差异。PP2A是异源三聚体，由α结构亚基、β调节亚基和γ催化亚基组成，是丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶调节细胞内的多种磷酸化机制，涉及细胞代谢、细胞周期、细胞凋亡、信号转导、基因表达和翻译等过程，在细胞内的表达受到严密调控，其表达水平相对恒定，但在某些情况下全反式维甲酸、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、游离的ATP和焦磷酸盐等可以使PP2A表达发生改变[6]，针灸和艾灸也能上调PP2A的活性及表达[7-8]，但其调节机制仍需进一步研究。
PKA的分子是由2个调节亚基和2个催化亚基构成的异四聚体。当cAMP不存在时，PKA以无活性的全酶状态存在；当PKA的调节亚基与cAMP结合时，导致调节亚基的构象改变而与催化亚基解离，产生2个激活的催化亚基单体。激活的PKA催化亚基通过对靶基因调节蛋白的磷酸化作用，进而影响到基因的表达或翻译，诱导细胞的应激反应。众多研究表明，运动对心脏、肝脏、血液、大脑海马等不同组织cAMP浓度有一定的影响[9]。侯伊玲等[10]在实验中发现大鼠急性心肌梗死后有氧训练8周，心肌cAMP 含量及PKA蛋白表达水平显著高于假手术组，通过有关信号途径改善心室功能。本研究显示运动使腓肠肌PKA mRNA和蛋白表达分别升高了15.5%和50.0%，但无显著性意义。
AMPK是一个异三聚体，由α催化亚基和β、γ调节亚基构成。AMPK是维持细胞能量代谢平衡的重要因子，激活AMPK的关键因素是ATP的下降和AMP的上升，AMP通过不同途径直接或间接激活AMPK，AMPK通过对下游相关能量代谢的靶蛋白的调节促进葡萄糖和脂肪酸的分解代谢和增加ATP含量同时降低糖原、甘油三酯和胆固醇的合成代谢、减少ATP的消耗，在葡萄糖、脂肪和胆固醇的代谢中具有重要作用。研究表明，运动对AMPK的激活由于强度、时间的不同，各个亚基的激活程度有所区别，而长时间的运动可使AMPK三个亚基的表达均有所上调，并且AMPK的活性亦随之上升[11]。而有的研究目前还存分歧，如在运动对骨骼肌中AMPKα1的诱导效应中升高、降低和无变化的结果均有报道[12]。本研究显示，四周的有氧训练显著升高大鼠腓肠肌AMPK mRNA和蛋白表达水平。 Mlx属于转录因子bHLH/ZIP家族的成员之一，分为α、β、γ三种亚型，组成Mlx环的氨基酸残基中的疏水性残基通过疏水键与ChREBP相结合，必须在Mlx存在的环境下，ChREBP才能与含有ChoRE的低聚核苷酸结合[13]。研究表明，显性抑制肝细胞Mlx，则使糖脂代谢的丙酮酸激酶、脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶等也完全受到抑制[14]。因此，Mlx是ChREBP在糖脂代谢中的重要功能性调节因子。本研究显示，运动组大鼠腓肠肌Mlx mRNA表达与安静组无显著差别，蛋白表达显著升高，提示有氧训练对大鼠骨骼肌Mlx的影响主要也是诱导蛋白表达。
本实验结果显示，运动组大鼠腓肠肌ChREBP mRNA表达水平与安静组无明显差异，提示有氧训练对骨骼肌ChREBP基因表达影响不大，这与我们早期研究[15]中发现的有氧训练对正常大鼠肝脏ChREBP基因表达影响结果相类似。但我们以往也发现有氧训练能使高糖高脂诱导的肝脏ChREBP基因过表达显著下降[16]，提示ChREBP在机体的表达具有良好的平衡调节机制，能根据机体的不同状态适当调节以适应机体生理机能的需要。运动组大鼠腓肠肌ChREBP蛋白表达水平显著低于安静组，提示有氧训练显著降低ChREBP蛋白含量。Iizuka等[1]在实验中发现，ChREBP基因敲除小鼠肝脏中参与脂肪酸合成的酶，包括脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶等、ATP-柠檬酸裂解酶和脂酰CoA去饱和酶1等的基因表达水平均较对照小鼠明显降低，导致肝脏脂肪酸合成率下降，体内脂肪组织含量显著降低。因此有氧训练降低ChREBP蛋白表达可能也是有氧运动降低体内脂肪含量的原因之一。有氧训练对ChREBP与Mlx蛋白表达影响不一致，提示它们各自可能存在其它的调节机制，具体仍需进一步研究。
本研究通过对影响ChREBP功能相关因子的观察显示，有氧训练降低使ChREBP去磷酸化的PP2A蛋白表达水平，同时升高使ChREBP磷酸化的PKA和AMPK蛋白表达水平，不利于ChREBP从细胞质转运到细胞核及ChREBP的DNA结合活性，使ChREBP的功能受到抑制，虽然MLx蛋白含量升高，但由于ChREBP本身蛋白和活性水平受到抑制，因此可能导致了其下游包括脂肪合成在内的相关靶基因转录水平的下调，进一步解释了有氧训练降低体脂的可能机制之一。
4总结
有氧训练一方面降低ChREBP蛋白表达水平，另一方面降低PP2A和升高PKA、AMPK蛋白表达水平，不利于ChREBP的转运及DNA结合活性，使ChREBP功能受到抑制，可能是有氧训练降低体脂的机制之一。
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