建立了液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)同时测定牛奶中雌酮、17α-雌二醇、17β-雌二醇和雌三醇4种雌性激素残留的方法。牛奶样品用乙腈振荡提取,经过NaCl脱水和低温冷冻除脂,然后用C18固相萃取柱净化,最后分析物采用Hydrosphere C18色谱柱分离,以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱,负离子电喷雾电离多反应监测模式进行定性和定量分析,同时优化液相色谱条件(流动相、柱流速和柱温)和质谱参数以提高检测灵敏度。以基质匹配外标法定量,方法线性相关系数r>0.999;雌酮、17α-雌二醇、17β-雌二醇和雌三醇定量限均为0.2μg/kg;各雌性激素的浓度添加水平均为0.2μg/kg、0.4μg/kg、1.0μg/kg时,雌性激素加标回收率范围在69.7~108.0%之间,相对标准偏差在4.3~10.5%之间。结果表明,该方法准确、可靠,适用于牛奶中雌性激素残留的检测。