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摘要：采用反复硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶色谱法等进行南海红树林内生真菌Gx-4c的代谢产物分离纯化，并通过理化常数测定和光谱分析鉴定其化学结构。研究结果： 从南海红树林内生真菌Gx-4c的菌体中分离得到4个代谢产物，经波谱解析，分离得到的4个化合物分别为：5，7-二羟基-2-甲基色原酮 （1）、 3 -羟基-2-甲基苯酸 （2）、3，4-二氢-8-羟基-3-甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮-5-羧酸（3）、3，4-二氢-8-羟基-3，5-二甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮（4）；初步药理活性显示化合物1对口腔癌细胞KB、KBv200的抗肿瘤活性值分别为7.5和11.2 Mol。研究结果表明：所有化合物均首次从南海红树林内生真菌Gx-4c中分离得到。
关键词：红树林；内生真菌；代谢产物
中图分类号：O629文献标识码：A文章编号：1003-4374（2013）01-0012-03
红树林是指生长在热带、亚热带潮间带上部，以红树植物为主体的常绿灌木或乔木组成的浅滩湿地木本生物群落，是一种陆地向海洋过渡的特殊生态系统[1] ，红树林生态系统中蕴藏着丰富的动植物资源和微生物资源。红树林栖息地被证明是真菌新种属的丰富来源， 形成了海洋真菌第二大生态学亚类。我们实验小组已从中国南海红树林内生真菌的次级代谢产物中分离到大量新颖的有活性结构的化合物[ 2-4] 。
本文对南海红树林内生真菌Gx-4c代谢产物进行研究，从菌体中分离得到4个化合物：5，7-二羟基-2-甲基色原酮（1）、3 -羟基-2-甲基苯酸 （2）、3，4-二氢-8-羟基-3-甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮-5-羧酸（3）、3，4-二氢-8-羟基-3，5-二甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮（4），初步药理活性显示化合物1对口腔癌细胞KB、KBv200的抗肿瘤活性值分别为7.5和11.2Mol。
1实验部分
1.1仪器和试剂
美国Varian公司INOVA-500NB超导核磁共振谱仪和INOVA-300NB核磁共振仪，VG ZAB-HS双聚焦质谱仪，Thermo DSQ电子轰击电离质谱仪，Thermo MAT95XP高分辨质谱仪；北京泰克仪器有限公司的X-4数字显示显微熔点测定仪。所用试剂均为广州化学试剂厂生产，化学纯、溶剂经重蒸后使用。柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的200-300目硅胶、硅胶H、 薄层硅胶GF254。
1.2菌种培养
红树林内生真菌Gx-4c采自中国香港，经鉴定为拟茎点霉菌（Phomopsis sp.），保存于中山大学化学与化学工程学院。发酵培养基为葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、酵母膏1g/L、粗海盐2g/L，pH7.0。500mL三角瓶内装培养基250mL，1.25×105Pa 灭菌20 min后接种120L，在25℃静置培养35d，分别收集发酵液和菌体。
1.3提取与分离
200L发酵物过滤得菌体和发酵液，发酵液浓缩后用乙酸乙酯充分萃取，菌体用甲醇多次浸泡。提取浓缩物分别以体积比1∶2拌硅胶（200-300目）进行柱层析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇进行梯度加压洗脱。收集各组分再经反复柱层析、制备薄层层析、重结晶等方法进行纯化。从菌体粗提物（约40g）分离得到化合物1 （ 8mg）、2 （10mg）、3 （7mg）、 4 （8mg） 。
1.4细胞毒活性实验
参考文献：
[1] 李倩茹， 李皓. 一株抗菌活性的红树林植物内生真菌的分离与鉴定[J]. 江西农业学报 2009， 21（7）：143-145.
[ 2] Lin Y C，Wu X Y， Feng S ， et al. Five Unique Compounds： Xyloketals fro m angrove Fungus Xylaria sp.from the South Chna Sea Coast[ J]. J Org Chem， 2001， 66 ： 6252-6256.
[ 3] Lin Y C， Wu X Y， Feng S ， et al . 1A novel N- cinnamoylcycl opepti decontai ning an all enic et her fro m t he f ungusXy l aria s p . （ strain #2508） from the Sout h Chi na Sea [ J]. Tetrahedron Letters， 2001， 42 ： 449-451.
[ 4] Chen G Y， Lin Y C， Wen L ， et a. l Two new m etabo lites o f a marine endophytic f ungus （ No11893 ） from an estuarine mangrove on the South China Sea coast[ J]. Tetrahedron， 2003 ， 59 ： 4907-4909.
[5] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival applica tion to proliferation and cytotoxicity assays [J]. Journal of immunological me thods， 1983， 65 （1-2）： 55-63.
[6] Jingqiu Dai， Karsten Krohn， Ulrich Florke， Siegfried Draeger， Barbara Schulz， Attila Kiss-Szikszai， Sándor Antus， Tibor Kurtán， Teunis van Ree. Metabolites from the Endophytic Fungus Nodulisporium sp. From Juniperus cedre[J]. Eur. J. Org. Chem. 2006，15：3498-3506.
[7] Dean RE， Midgley A， White EN， et al. Synthesis of some new phenols. J. Chem. Soc.， 1961： 2773-2779.
[8] Chinworrungsee M， Kittakoop P， Isaka M， Rungrod A， Tanticharoen M， Thebtaranonth Y. Antimalarial halorosellinic acid from the marine fungus Halorosellinia oceanica. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 2001， 11：1965-1969.
关键词：红树林；内生真菌；代谢产物
中图分类号：O629文献标识码：A文章编号：1003-4374（2013）01-0012-03
红树林是指生长在热带、亚热带潮间带上部，以红树植物为主体的常绿灌木或乔木组成的浅滩湿地木本生物群落，是一种陆地向海洋过渡的特殊生态系统[1] ，红树林生态系统中蕴藏着丰富的动植物资源和微生物资源。红树林栖息地被证明是真菌新种属的丰富来源， 形成了海洋真菌第二大生态学亚类。我们实验小组已从中国南海红树林内生真菌的次级代谢产物中分离到大量新颖的有活性结构的化合物[ 2-4] 。
本文对南海红树林内生真菌Gx-4c代谢产物进行研究，从菌体中分离得到4个化合物：5，7-二羟基-2-甲基色原酮（1）、3 -羟基-2-甲基苯酸 （2）、3，4-二氢-8-羟基-3-甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮-5-羧酸（3）、3，4-二氢-8-羟基-3，5-二甲基-1H-2-苯吡喃-1-酮（4），初步药理活性显示化合物1对口腔癌细胞KB、KBv200的抗肿瘤活性值分别为7.5和11.2Mol。
1实验部分
1.1仪器和试剂
美国Varian公司INOVA-500NB超导核磁共振谱仪和INOVA-300NB核磁共振仪，VG ZAB-HS双聚焦质谱仪，Thermo DSQ电子轰击电离质谱仪，Thermo MAT95XP高分辨质谱仪；北京泰克仪器有限公司的X-4数字显示显微熔点测定仪。所用试剂均为广州化学试剂厂生产，化学纯、溶剂经重蒸后使用。柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的200-300目硅胶、硅胶H、 薄层硅胶GF254。
1.2菌种培养
红树林内生真菌Gx-4c采自中国香港，经鉴定为拟茎点霉菌（Phomopsis sp.），保存于中山大学化学与化学工程学院。发酵培养基为葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、酵母膏1g/L、粗海盐2g/L，pH7.0。500mL三角瓶内装培养基250mL，1.25×105Pa 灭菌20 min后接种120L，在25℃静置培养35d，分别收集发酵液和菌体。
1.3提取与分离
200L发酵物过滤得菌体和发酵液，发酵液浓缩后用乙酸乙酯充分萃取，菌体用甲醇多次浸泡。提取浓缩物分别以体积比1∶2拌硅胶（200-300目）进行柱层析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇进行梯度加压洗脱。收集各组分再经反复柱层析、制备薄层层析、重结晶等方法进行纯化。从菌体粗提物（约40g）分离得到化合物1 （ 8mg）、2 （10mg）、3 （7mg）、 4 （8mg） 。
1.4细胞毒活性实验
参考文献：
[1] 李倩茹， 李皓. 一株抗菌活性的红树林植物内生真菌的分离与鉴定[J]. 江西农业学报 2009， 21（7）：143-145.
[ 2] Lin Y C，Wu X Y， Feng S ， et al. Five Unique Compounds： Xyloketals fro m angrove Fungus Xylaria sp.from the South Chna Sea Coast[ J]. J Org Chem， 2001， 66 ： 6252-6256.
[ 3] Lin Y C， Wu X Y， Feng S ， et al . 1A novel N- cinnamoylcycl opepti decontai ning an all enic et her fro m t he f ungusXy l aria s p . （ strain #2508） from the Sout h Chi na Sea [ J]. Tetrahedron Letters， 2001， 42 ： 449-451.
[ 4] Chen G Y， Lin Y C， Wen L ， et a. l Two new m etabo lites o f a marine endophytic f ungus （ No11893 ） from an estuarine mangrove on the South China Sea coast[ J]. Tetrahedron， 2003 ， 59 ： 4907-4909.
[5] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival applica tion to proliferation and cytotoxicity assays [J]. Journal of immunological me thods， 1983， 65 （1-2）： 55-63.
[6] Jingqiu Dai， Karsten Krohn， Ulrich Florke， Siegfried Draeger， Barbara Schulz， Attila Kiss-Szikszai， Sándor Antus， Tibor Kurtán， Teunis van Ree. Metabolites from the Endophytic Fungus Nodulisporium sp. From Juniperus cedre[J]. Eur. J. Org. Chem. 2006，15：3498-3506.
[7] Dean RE， Midgley A， White EN， et al. Synthesis of some new phenols. J. Chem. Soc.， 1961： 2773-2779.
[8] Chinworrungsee M， Kittakoop P， Isaka M， Rungrod A， Tanticharoen M， Thebtaranonth Y. Antimalarial halorosellinic acid from the marine fungus Halorosellinia oceanica. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters， 2001， 11：1965-1969.