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摘要：目的 观察丛枝菌根真菌（AMF）对植物的侵染过程及其规律。方法 采用数码显微成像系统对侵染结构进行了观察，测定6种AMF对4种药用植物的侵染率；采用湿筛法对AMF孢子进行分离并拍照。结果 试验发现不同种AMF对同种植物的侵染率有较大差别，不同植物对相同菌种的选择也有较大差别。结论 摩西球囊霉、根内球囊霉等AMF对上述药用植物均具有较高的侵染率，因此可作为药用植物的丛枝菌根研究首选菌种。
关键词：药用植物；丛枝菌根；侵染率；选择性
中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）01-0053-03
丛枝菌根（arbuscular mycorrhizas，AM）为分布最广泛的菌根类型。丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）可以与80%的陆生植物形成AM共生体[1]。AM的形成不仅可以增强植物的氮、磷营养的供应，还可以增强植物在多种胁迫环境下的抗逆性[2]，增强植物的生物量及有效成分[3-6]。AM的功能与其结构紧密相关，AM与植物共生体的根内结构形成了植物与真菌的物质交换层，根外菌丝则是真菌从土壤中吸收养分的基础[7]。
AMF对植物的侵染过程包括一系列的相互识别过程。AM孢子萌发后，菌丝不断分枝呈扇形生长分布，在与植物根接触后，AMF在植物根的表面形成附着胞。附着胞在AMF产生的识别信号物质与植物产生的识别信号物质相互识别后，进入植物根内[8]。有的菌丝进入植物细胞，并且形成连续二岔状分支，即丛枝结构（arbuscular）。其根外菌丝则进入土壤吸收矿质营养。在与植物共生1个月左右时菌丝会生成泡囊或孢子。由于AM与植物之间存在选择性，因此，不同的菌种侵染相同的植物结果可能不同，而相同的菌种侵染不同植物结果也有可能不同。明确二者之间的选择关系对药用植物AM研究十分重要。本研究用6种AMF对4种药用植物进行了侵染试验，并且用频率法测定了AMF的侵染率，得到了4种药用植物与6种AMF的选择性规律。该试验可以对药用植物AM研究提供指导和参考。
1 实验材料
土壤准备，土壤采集于中国医学科学院药用植物研所实验基地10～30 cm表层土。土壤高压湿热灭菌121 ℃灭菌90 min，晾晒2 d后，过筛，继续翻动晾晒5 d以上，至干。
黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）种子，采自山东；疏柔毛罗勒（Ocimum basilicum non L.）种子，来源于安徽阜阳；青蒿（Artemisia annua L.）种子，来源于广西；苍术（Atractylodes lancea （Thunb） DC.）种子，来源于江苏。检测发芽率均高于80%，种子活力良好。
2 实验方法
种子表面灭菌：黄芩、苍术、青蒿、罗勒种子净选后置于流水中冲洗1 h，然后用75%乙醇快速灭菌30 s，放入10%H2O2灭菌10～20 min，无菌水冲洗数次。25 ℃催芽24 h后备用（苍术15 ℃避光催芽7 d）。
接种条件：取400 g灭菌土壤至500 g花盆中，加入AM菌剂，菌剂用量1%，敷少量土壤，播入种子，使种子位于菌剂的正上方，再覆土约100 g。
培养条件：光照0～144 ?mol/（m2·s）；人工气候室温度15～25 ℃；播种时加水125 mL至水分饱和，待植物生长稳定后，水分保持土壤饱和含水量的70%；栽培周期2～3个月，收获。将根流水冲洗干净后，置于FAA固定液中保存，待测。
根的测定前处理：将植物根系展开均匀取样。剪取50根以上长约1 cm根段，先放入10% KOH于90 ℃水浴加热20～100 min，1%H2O2漂白数次，放入2%HCl酸化，然后至乳酸酸性品红染色液染色，置分色液中分色，将根段排于载玻片上，加入2滴乳酸液后加盖玻片，观察。
3 结果
经过染色处理后发现，植物组织几乎为透明，在皮层细胞中可见横走的菌丝；部分皮层细胞内部见丛枝分布，在高倍镜下可见丛枝为菜花状结构；泡囊有菌丝连接，为膨大的近球形结构，泡囊为孢子的前体，有的根段可见泡囊分布。根外可见有菌丝分布，部分菌丝可见连接成熟的厚壁孢子。
4 讨论
4.1 不同药用植物的处理方法
由于样品不能及时测定，因此，本试验所有样品均用FAA固定液进行了固定。在实际操作中，如果样品可以直接测定，该过程可以省去。10%KOH透化的时间视材料的厚度而定，如果根的质地较硬，那么该时间可以适当加长。1%H2O2漂白的时间长短和次数均视材料的颜色而定，一般3次漂洗可以使植物根系变白。酸化时间不固定，只要保证材料被均匀酸化即可。染色时间和温度与分色时间和温度应相对应：一般情况下90 ℃、20 min可以染色充分，分色可常温过夜分色，或高温分色1 h以上。在分色和制片过程中应避免材料与水接触引起真菌材料的脱色。
几种受试材料中，黄芩、罗勒、青蒿的根粗细较为适中，因此采用较短的10%KOH透化时间，而苍术的根较粗，适当加长了10%KOH透化时间。在进行黄芩测定时，按照农业上的方法测定，结果发现黄芩的根颜色较重。因此，试验中加长了10%KOH透化时间，并且加长了1%H2O2浸泡时间，透明效果较好。另有报道以1%碱性H2O2（30 mL 10%H2O2，3 mL NH4OH，570 mL蒸馏水）软化植物根，该步骤对幼嫩根可以省去[9]，但试验中发现1%H2O2漂洗可以使植物根漂白，去除杂色的干扰，因此保留了此步骤。不过H2O2有使植物根内产生气泡的缺点，在制片和拍照过程易产生干扰。
4.2 药用植物与AMF的选择性和规律性
由结果可知，不同菌种对同一植物的选择性不同，而且差异较大；不同植物对相同菌种的选择也存在明显差异。造成这种差别的原因可能是因为某些菌种的侵染对象范围较窄。例如，在试验中G.C2在不同植物的上表现出的差异性较大，可能与其对植物的选择性相关。因此在进行药用植物的特定AMF接种试验时应考虑二者的选择性，选择适当的对象进行侵染培养。 AMF与药用植物的侵染还存在一定的规律性，即同一菌种和对不同植物均表现出了较高的侵染水平。例如，G.M、G.I，对不同植物均表现出了较高的侵染率，这也与其他报道相一致[10]，G.M、G.I的这种特性可能与其对植物的普遍适应性相关。因此在药用植物的共生AMF本底不明的情况下，可以用这2种AMF进行侵染试验。
参考文献：
[1] Smith SE， Read DJ. Mycorrhizal symbiosis[M]. Cambridge，UK：Academic Press，1997.
[2] 郭兰萍，汪洪钢，黄璐琦，等.泡囊丛枝菌根（AM）对苍术生长发育及挥发油成分的影响[J].中国药用植物杂志，2006，31（18）：1491.
[3] Rosa Porcel， Ricardo Aroca， Rosario Azcón， et al. PIP aquaporin gene expression in arbuscular mycorrhizal glycine max and Lactuca sativa plants in relation to drought stress tolerance[J]. Plant Molecular Biology，2006，60（3）：389.
[4] Marcel Bucher. Functional biology of plant phosphate uptake at root and mycorrhiza interfaces[J]. New Phytologist，2007，173（1）：11.
[5] Kaldore M， Kuhn， AJ， Schr?der WH， et al. Selective element deposits in maize colonized by a heavy metal tolerance conferring arbuscular mycorrhizal fungus[J]. Journal of Plant Physiology， 1999，154（5/6）：718.
[6] M Miransari， HA Bahrami， F Rejali. Using arbuscular mycorrhiza to alleviate the stress of soil compaction on wheat （Triticum aestivum L.） growth[J]. Soil Biology and Biochemistry，2008， 40（5）：1197.
[7] 中国农业百科全书编辑部.中国农业百科全书：土壤卷[M].北京：中国农业出版社，1996.
[8] Akiyama K， Hayashi. Strigolactones：chemical signals for fungal symbionts and paraitic weeds in plant roots[J]. Annals of Botany，2006，97（6）：925-931.
[9] 严小龙.根系生物学原理和应用[M].北京：科学出版社，2007.
[10] Paul-Olivier Redon & Thierry Béguiristain. Differential effects of AM fungal isolates on Medicago truncatula growth and metal uptake in a multimetallic （Cd， Zn， Pb） contaminated agricultural soil[J]. Mycorrhiza，2009，19（3）：187-195.
（收稿日期：2010-10-14）
（修回日期：2011-08-10，编辑：华强）
关键词：药用植物；丛枝菌根；侵染率；选择性
中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）01-0053-03
丛枝菌根（arbuscular mycorrhizas，AM）为分布最广泛的菌根类型。丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）可以与80%的陆生植物形成AM共生体[1]。AM的形成不仅可以增强植物的氮、磷营养的供应，还可以增强植物在多种胁迫环境下的抗逆性[2]，增强植物的生物量及有效成分[3-6]。AM的功能与其结构紧密相关，AM与植物共生体的根内结构形成了植物与真菌的物质交换层，根外菌丝则是真菌从土壤中吸收养分的基础[7]。
AMF对植物的侵染过程包括一系列的相互识别过程。AM孢子萌发后，菌丝不断分枝呈扇形生长分布，在与植物根接触后，AMF在植物根的表面形成附着胞。附着胞在AMF产生的识别信号物质与植物产生的识别信号物质相互识别后，进入植物根内[8]。有的菌丝进入植物细胞，并且形成连续二岔状分支，即丛枝结构（arbuscular）。其根外菌丝则进入土壤吸收矿质营养。在与植物共生1个月左右时菌丝会生成泡囊或孢子。由于AM与植物之间存在选择性，因此，不同的菌种侵染相同的植物结果可能不同，而相同的菌种侵染不同植物结果也有可能不同。明确二者之间的选择关系对药用植物AM研究十分重要。本研究用6种AMF对4种药用植物进行了侵染试验，并且用频率法测定了AMF的侵染率，得到了4种药用植物与6种AMF的选择性规律。该试验可以对药用植物AM研究提供指导和参考。
1 实验材料
土壤准备，土壤采集于中国医学科学院药用植物研所实验基地10～30 cm表层土。土壤高压湿热灭菌121 ℃灭菌90 min，晾晒2 d后，过筛，继续翻动晾晒5 d以上，至干。
黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）种子，采自山东；疏柔毛罗勒（Ocimum basilicum non L.）种子，来源于安徽阜阳；青蒿（Artemisia annua L.）种子，来源于广西；苍术（Atractylodes lancea （Thunb） DC.）种子，来源于江苏。检测发芽率均高于80%，种子活力良好。
2 实验方法
种子表面灭菌：黄芩、苍术、青蒿、罗勒种子净选后置于流水中冲洗1 h，然后用75%乙醇快速灭菌30 s，放入10%H2O2灭菌10～20 min，无菌水冲洗数次。25 ℃催芽24 h后备用（苍术15 ℃避光催芽7 d）。
接种条件：取400 g灭菌土壤至500 g花盆中，加入AM菌剂，菌剂用量1%，敷少量土壤，播入种子，使种子位于菌剂的正上方，再覆土约100 g。
培养条件：光照0～144 ?mol/（m2·s）；人工气候室温度15～25 ℃；播种时加水125 mL至水分饱和，待植物生长稳定后，水分保持土壤饱和含水量的70%；栽培周期2～3个月，收获。将根流水冲洗干净后，置于FAA固定液中保存，待测。
根的测定前处理：将植物根系展开均匀取样。剪取50根以上长约1 cm根段，先放入10% KOH于90 ℃水浴加热20～100 min，1%H2O2漂白数次，放入2%HCl酸化，然后至乳酸酸性品红染色液染色，置分色液中分色，将根段排于载玻片上，加入2滴乳酸液后加盖玻片，观察。
3 结果
经过染色处理后发现，植物组织几乎为透明，在皮层细胞中可见横走的菌丝；部分皮层细胞内部见丛枝分布，在高倍镜下可见丛枝为菜花状结构；泡囊有菌丝连接，为膨大的近球形结构，泡囊为孢子的前体，有的根段可见泡囊分布。根外可见有菌丝分布，部分菌丝可见连接成熟的厚壁孢子。
4 讨论
4.1 不同药用植物的处理方法
由于样品不能及时测定，因此，本试验所有样品均用FAA固定液进行了固定。在实际操作中，如果样品可以直接测定，该过程可以省去。10%KOH透化的时间视材料的厚度而定，如果根的质地较硬，那么该时间可以适当加长。1%H2O2漂白的时间长短和次数均视材料的颜色而定，一般3次漂洗可以使植物根系变白。酸化时间不固定，只要保证材料被均匀酸化即可。染色时间和温度与分色时间和温度应相对应：一般情况下90 ℃、20 min可以染色充分，分色可常温过夜分色，或高温分色1 h以上。在分色和制片过程中应避免材料与水接触引起真菌材料的脱色。
几种受试材料中，黄芩、罗勒、青蒿的根粗细较为适中，因此采用较短的10%KOH透化时间，而苍术的根较粗，适当加长了10%KOH透化时间。在进行黄芩测定时，按照农业上的方法测定，结果发现黄芩的根颜色较重。因此，试验中加长了10%KOH透化时间，并且加长了1%H2O2浸泡时间，透明效果较好。另有报道以1%碱性H2O2（30 mL 10%H2O2，3 mL NH4OH，570 mL蒸馏水）软化植物根，该步骤对幼嫩根可以省去[9]，但试验中发现1%H2O2漂洗可以使植物根漂白，去除杂色的干扰，因此保留了此步骤。不过H2O2有使植物根内产生气泡的缺点，在制片和拍照过程易产生干扰。
4.2 药用植物与AMF的选择性和规律性
由结果可知，不同菌种对同一植物的选择性不同，而且差异较大；不同植物对相同菌种的选择也存在明显差异。造成这种差别的原因可能是因为某些菌种的侵染对象范围较窄。例如，在试验中G.C2在不同植物的上表现出的差异性较大，可能与其对植物的选择性相关。因此在进行药用植物的特定AMF接种试验时应考虑二者的选择性，选择适当的对象进行侵染培养。 AMF与药用植物的侵染还存在一定的规律性，即同一菌种和对不同植物均表现出了较高的侵染水平。例如，G.M、G.I，对不同植物均表现出了较高的侵染率，这也与其他报道相一致[10]，G.M、G.I的这种特性可能与其对植物的普遍适应性相关。因此在药用植物的共生AMF本底不明的情况下，可以用这2种AMF进行侵染试验。
参考文献：
[1] Smith SE， Read DJ. Mycorrhizal symbiosis[M]. Cambridge，UK：Academic Press，1997.
[2] 郭兰萍，汪洪钢，黄璐琦，等.泡囊丛枝菌根（AM）对苍术生长发育及挥发油成分的影响[J].中国药用植物杂志，2006，31（18）：1491.
[3] Rosa Porcel， Ricardo Aroca， Rosario Azcón， et al. PIP aquaporin gene expression in arbuscular mycorrhizal glycine max and Lactuca sativa plants in relation to drought stress tolerance[J]. Plant Molecular Biology，2006，60（3）：389.
[4] Marcel Bucher. Functional biology of plant phosphate uptake at root and mycorrhiza interfaces[J]. New Phytologist，2007，173（1）：11.
[5] Kaldore M， Kuhn， AJ， Schr?der WH， et al. Selective element deposits in maize colonized by a heavy metal tolerance conferring arbuscular mycorrhizal fungus[J]. Journal of Plant Physiology， 1999，154（5/6）：718.
[6] M Miransari， HA Bahrami， F Rejali. Using arbuscular mycorrhiza to alleviate the stress of soil compaction on wheat （Triticum aestivum L.） growth[J]. Soil Biology and Biochemistry，2008， 40（5）：1197.
[7] 中国农业百科全书编辑部.中国农业百科全书：土壤卷[M].北京：中国农业出版社，1996.
[8] Akiyama K， Hayashi. Strigolactones：chemical signals for fungal symbionts and paraitic weeds in plant roots[J]. Annals of Botany，2006，97（6）：925-931.
[9] 严小龙.根系生物学原理和应用[M].北京：科学出版社，2007.
[10] Paul-Olivier Redon & Thierry Béguiristain. Differential effects of AM fungal isolates on Medicago truncatula growth and metal uptake in a multimetallic （Cd， Zn， Pb） contaminated agricultural soil[J]. Mycorrhiza，2009，19（3）：187-195.
（收稿日期：2010-10-14）
（修回日期：2011-08-10，编辑：华强）