目的使用单链抗体偶联荧光染料构建探针进行磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)阳性肝癌的体内外检测。方法通过Overlap聚合酶链反应(PCR)采用柔性肽G4S将罗氏公司开发的Codrituzumab轻链与重链连接,构建工程载体,并通过毕赤酵母进行表达纯化,获得靶向GPC3的单链抗体;采用流式细胞术检测单链抗体对GPC3阳性肝癌细胞Huh-7的结合能力;将单链抗体与碱性荧光染料罗丹明B偶联,使用激光共聚焦检测单链抗体在体外对Huh-7细胞的靶向能力;将单链抗体与近红外荧光染料NIRB-NHS偶联,通过CCD照相机实时收集荧光信号检测偶联探针在荷瘤裸鼠体内的靶向能力,并判断其开发为检测试剂的潜力。结果通过基因工程手段和毕赤酵母表达,成功获得抗GPC3单链抗体,经WB鉴定结果说明单链抗体AntiGPC3scFv表达及装配正确。流式细胞术检测Anti-GPC3scFv与肝癌细胞Huh-7的结合率为40.3%。体外靶向性试验验证单链抗体Anti-GPC3scFv可在体外很好地靶向肝癌细胞Huh-7,单链抗体组细胞平均荧光强度为218.61±9.03,明显优于对照组的31.74±5.28。体内近红外成像试验中,通过Huh-7细胞移植荷瘤裸鼠给药后的荧光信号分析结果显示,单链抗体探针可以很好地靶向至肿瘤部位,分析热点区域的最大肿瘤/正常组织荧光信号比可知,单链抗体组信号比为8.27±2.94,明显强于对照组的1.09±0.63。结论采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了单链抗体Anti-GPC3scFv。单链抗体保留了母本抗体的结合能力,并体现了很好的体外和体内靶向能力,其靶向能力可应用于GPC3阳性肝癌的检测领域,拥有潜在的临床应用前景。