论文部分内容阅读
摘要：文章通过对山楂植物进行概述，设计关于山楂叶总黄酮提取的实验研究，实验采用分析纯试剂和实验室提供山楂叶为实验原料，利用芦丁质量浓度 C（mg/mL）与吸光度 A 之间的回归方程为判别提取率方法，结果测得总黄酮得率的相对标准偏差（RSD）为 2.2%，表明该方法重复性良好。
1 山楂植物概述
山楂为蔷薇科（Rasaceae）山楂属（CrataegusL.）植物，全世界山楂属植物共有140 多种，我国植物志记载共有 17 种 2 个变种。山楂属植物在我国已有3000多年的栽培历史，栽培面积广，据1990年统计，全国山楂栽培面积达35万hm2，2003年统计栽培面积已达530万亩，主要分布在东北、华北、山西、广西、云南等地，中国植物志将中国山楂按植物学特性分为6组，包括麻核组、羽裂组、毛序组、光核组、浅裂组、楔形组。山楂化学成分的研究追溯于 1921 年，当时的研究热点主要集中于纤维素、鞣质、三萜等成分，随着对山楂研究的逐步深入，研究者发现山楂中的黄酮类化合物对心血管疾病具有良好的药理作用，同时人们发现山楂叶具有和山楂果相同的功效，开始将研究方向转移到山楂叶上，通过一定的分离手段从山楂叶中分离出各种黄酮类化合物。近年来随着检测技术的发展，对山楂叶中的氨基酸、微量元素及有机酸等也有了进一步研究。
2 材料和方法
黄酮类化合物是山楂叶主要的功能活性物质，总黄酮提取工艺成为提高山楂叶利用价值的关键所在，因此开发出一种操作简单、环保无害、适用性强的黄酮提取工艺，对提高山楂叶的附加利用价值具有重要的实践指导意义。
2.1 材料
山楂叶（Crataegus pinnatifida Bge.）实验室采购实验用样品，芦丁标准品，阿拉丁试剂（上海）有限公司;无水乙醇、甲醇、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠等，国药集团化学试剂有限公司，以上化学试剂均为分析纯。
2.2 仪器设备
酶标仪 Spectra Max 190，美国 Molecular Devices 公司;KQ-600DV 数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司;RHP-100 高速多功能粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司;Mettler ME204 型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司;RE-2000E 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。
2.3 方法
根据文献进行改进，采用倍比稀释法制备浓度为 0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/mL 的芦丁标准液。精密吸取 50μL 芦丁标准溶液，加入 0.5mol/L NaNO2溶液 20μL，静置 5min;加入 0.3mol/L AlCl3溶液 20μL，静置 6min;最后加入 0.5mol/L NaOH溶液 200μL，在酶标仪中振荡 30s，以试剂空白作对照，于 510nm 下测定吸光度。芦丁质量浓度 C（mg/mL）与吸光度 A 之间的回归方程为：
A=1.5399C+0.0062（R2=0.9998）
3总黄酮提取
准确称取 1.000g 山楂叶粉末于 100mL 具塞三角瓶中，以一定料液比加入一定体积分数的乙醇溶液，在一定温度下超声提取一定时间后抽滤，滤液转入 100mL 容量瓶中，定容，精密吸取适量样液按照标准曲线制作方法测定吸光度，计算总黄酮得率，计算公式如下：
提取率=cv/W
式中：C 为粗提液总黄酮质量浓度（mg/m L）;V 为粗提液体积（m L）;W 为原料质量（g）。再进行单因素影响实验，料液比 1：30，提取温度 70℃，超声功率 420W，以不同乙醇体积分数 40%、50%、60%、70%、80%、90%为溶剂提取 30min，考察乙醇体积分数对总黄酮得率的影响;以 70%乙醇为溶剂，料液比 1：30，提取时间 30min，超声功率 420W，设置不同温度 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃提取，考察提取温度对总黃酮得率的影响;以 70%乙醇为溶剂，提取温度 70℃，料液比 1：30，超声功率 420W，设置不同时间 10min、20min、30min、40min、50min、60min 提取，考察提取时间对总黄酮得率的影响;以 70%乙醇为溶剂，提取温度 70℃，提取时间 40min，超声功率 420W，设置不同料液比 1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40 提取，考察料液比对总黄酮得率的影响;每个处理重复 3 次。
4 结果
取浓度为 0.25mg/mL 的芦丁标准液重复测定 5 次，求得相对标准偏差（RSD）为 1.18%，表明该方法精密度良好。取同一批山楂叶样品制备 5 份粗提液，结果测得总黄酮得率的相对标准偏差（RSD）为 2.2%，表明该方法重复性良好。
参考文献
[1] Effect of Total Flavone of Haw Leaves on Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor and Other Related Factors in Nonalcoholic Steatohepatitis Rats[J]. WANG De-jun，CAI Yue-qin，PAN Shui-zhen， ZHANG Li-zong，CHEN Yun-xiang，CHEN Fang-ming， JIN Ming，YAN Mao-xiang，LI Xiao-dong， CHEN Zhi-yun. Chinese Journal of Integrative Medicine. 2018（04）
[2]山楂叶总黄酮的药理作用研究进展[J]. 马琳，李六水. 天津药学. 2017（05）
[3]大孔树脂吸附法富集山楂叶总黄酮的工艺研究[J]. 赵玉华，岑明政，范海珠. 中国生化药物杂志. 2017（08）
[4]微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺优化[J]. 施昶，黄海飞，李梦园，沈诗偲，韩伟. 生物加工过程. 2017（01）
[5]山楂叶提取物不同极性组分的体外抗氧化作用[J]. 龚霞，巫永华，刘恩岐，李超，陈尚龙. 食品工业. 2016（08）
[6]山楂叶总黄酮抑制慢性脑缺血模型大鼠脑组织神经元的凋亡（英文）[J]. 檀荣方，夏爱华，吴晓光，曹娜娜，李蒙蒙，张天鸽，王义茹，岳志领. 中国组织工程研究. 2014（49）
[7]山楂叶黄酮类成分提取纯化工艺研究[J]. 孙君凯，王帅，包永睿，孟宪生. 辽宁中医药大学学报. 2014（06）
[8]双水相系统纯化山楂叶中黄酮类物质的研究[J]. 赵立辉，武文洁，杨昱涵. 天然产物研究与开发. 2009（05）
1 山楂植物概述
山楂为蔷薇科（Rasaceae）山楂属（CrataegusL.）植物，全世界山楂属植物共有140 多种，我国植物志记载共有 17 种 2 个变种。山楂属植物在我国已有3000多年的栽培历史，栽培面积广，据1990年统计，全国山楂栽培面积达35万hm2，2003年统计栽培面积已达530万亩，主要分布在东北、华北、山西、广西、云南等地，中国植物志将中国山楂按植物学特性分为6组，包括麻核组、羽裂组、毛序组、光核组、浅裂组、楔形组。山楂化学成分的研究追溯于 1921 年，当时的研究热点主要集中于纤维素、鞣质、三萜等成分，随着对山楂研究的逐步深入，研究者发现山楂中的黄酮类化合物对心血管疾病具有良好的药理作用，同时人们发现山楂叶具有和山楂果相同的功效，开始将研究方向转移到山楂叶上，通过一定的分离手段从山楂叶中分离出各种黄酮类化合物。近年来随着检测技术的发展，对山楂叶中的氨基酸、微量元素及有机酸等也有了进一步研究。
2 材料和方法
黄酮类化合物是山楂叶主要的功能活性物质，总黄酮提取工艺成为提高山楂叶利用价值的关键所在，因此开发出一种操作简单、环保无害、适用性强的黄酮提取工艺，对提高山楂叶的附加利用价值具有重要的实践指导意义。
2.1 材料
山楂叶（Crataegus pinnatifida Bge.）实验室采购实验用样品，芦丁标准品，阿拉丁试剂（上海）有限公司;无水乙醇、甲醇、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠等，国药集团化学试剂有限公司，以上化学试剂均为分析纯。
2.2 仪器设备
酶标仪 Spectra Max 190，美国 Molecular Devices 公司;KQ-600DV 数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司;RHP-100 高速多功能粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司;Mettler ME204 型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司;RE-2000E 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。
2.3 方法
根据文献进行改进，采用倍比稀释法制备浓度为 0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/mL 的芦丁标准液。精密吸取 50μL 芦丁标准溶液，加入 0.5mol/L NaNO2溶液 20μL，静置 5min;加入 0.3mol/L AlCl3溶液 20μL，静置 6min;最后加入 0.5mol/L NaOH溶液 200μL，在酶标仪中振荡 30s，以试剂空白作对照，于 510nm 下测定吸光度。芦丁质量浓度 C（mg/mL）与吸光度 A 之间的回归方程为：
A=1.5399C+0.0062（R2=0.9998）
3总黄酮提取
准确称取 1.000g 山楂叶粉末于 100mL 具塞三角瓶中，以一定料液比加入一定体积分数的乙醇溶液，在一定温度下超声提取一定时间后抽滤，滤液转入 100mL 容量瓶中，定容，精密吸取适量样液按照标准曲线制作方法测定吸光度，计算总黄酮得率，计算公式如下：
提取率=cv/W
式中：C 为粗提液总黄酮质量浓度（mg/m L）;V 为粗提液体积（m L）;W 为原料质量（g）。再进行单因素影响实验，料液比 1：30，提取温度 70℃，超声功率 420W，以不同乙醇体积分数 40%、50%、60%、70%、80%、90%为溶剂提取 30min，考察乙醇体积分数对总黄酮得率的影响;以 70%乙醇为溶剂，料液比 1：30，提取时间 30min，超声功率 420W，设置不同温度 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃提取，考察提取温度对总黃酮得率的影响;以 70%乙醇为溶剂，提取温度 70℃，料液比 1：30，超声功率 420W，设置不同时间 10min、20min、30min、40min、50min、60min 提取，考察提取时间对总黄酮得率的影响;以 70%乙醇为溶剂，提取温度 70℃，提取时间 40min，超声功率 420W，设置不同料液比 1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40 提取，考察料液比对总黄酮得率的影响;每个处理重复 3 次。
4 结果
取浓度为 0.25mg/mL 的芦丁标准液重复测定 5 次，求得相对标准偏差（RSD）为 1.18%，表明该方法精密度良好。取同一批山楂叶样品制备 5 份粗提液，结果测得总黄酮得率的相对标准偏差（RSD）为 2.2%，表明该方法重复性良好。
参考文献
[1] Effect of Total Flavone of Haw Leaves on Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor and Other Related Factors in Nonalcoholic Steatohepatitis Rats[J]. WANG De-jun，CAI Yue-qin，PAN Shui-zhen， ZHANG Li-zong，CHEN Yun-xiang，CHEN Fang-ming， JIN Ming，YAN Mao-xiang，LI Xiao-dong， CHEN Zhi-yun. Chinese Journal of Integrative Medicine. 2018（04）
[2]山楂叶总黄酮的药理作用研究进展[J]. 马琳，李六水. 天津药学. 2017（05）
[3]大孔树脂吸附法富集山楂叶总黄酮的工艺研究[J]. 赵玉华，岑明政，范海珠. 中国生化药物杂志. 2017（08）
[4]微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺优化[J]. 施昶，黄海飞，李梦园，沈诗偲，韩伟. 生物加工过程. 2017（01）
[5]山楂叶提取物不同极性组分的体外抗氧化作用[J]. 龚霞，巫永华，刘恩岐，李超，陈尚龙. 食品工业. 2016（08）
[6]山楂叶总黄酮抑制慢性脑缺血模型大鼠脑组织神经元的凋亡（英文）[J]. 檀荣方，夏爱华，吴晓光，曹娜娜，李蒙蒙，张天鸽，王义茹，岳志领. 中国组织工程研究. 2014（49）
[7]山楂叶黄酮类成分提取纯化工艺研究[J]. 孙君凯，王帅，包永睿，孟宪生. 辽宁中医药大学学报. 2014（06）
[8]双水相系统纯化山楂叶中黄酮类物质的研究[J]. 赵立辉，武文洁，杨昱涵. 天然产物研究与开发. 2009（05）