论文部分内容阅读
摘 要：为了解山东省淄博市市售生食贝类中副溶血性弧菌的污染状况和毒力基因的携带情况，分别于2019年8、9、10月从不同区县的零售市场采集牡蛎和毛蚶样品共40份，运用副溶血性弧菌MPN定量法和多重荧光MPN-PCR法对副溶血性弧菌的污染状况和毒力基因的携带情况进行调查。结果显示，副溶血性弧菌（tlh基因）检出率为47.50%（19/40），其中污染量≥110MPN/g的样品占26.00%（5/19）;毒力基因（tdh、trh）阳性15份，携带率37.50%（15/40），其中牡蛎携带率为45.00%（9/20），毛蚶携带率为30.00%（6/20）。故得出结论，淄博市市售牡蛎和毛蚶中副溶血性弧菌的污染水平较高，存在一定的食品安全风险。
关键词：副溶血性弧菌 MPN定量法 多重荧光PCR法 毒力基因
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种嗜盐性革兰氏阴性菌，其普遍存在于海产品中。食用被该菌污染的食品后，人体常会出现腹泻、呕吐等胃肠道反应，严重者可发生休克[1]。据报道，近年来由副溶血性弧菌引发的食物中毒呈现出明显的上升趋势——已超过沙门氏菌位居首位[2]。在沿海省份和地市，由副溶血性弧菌导致的食源性疾病事件占总数的一半以上[3-4]。研究发现，耐热性直接溶血素（TDH）、TDH相关的溶血素（TRH）与副溶血弧菌致病性密切相关，被认为是其主要毒力因子[5]。因此，本文对2019年山东省淄博市市售生食贝类中副溶血性弧菌的污染状况和毒力基因携带情况进行了分析，以期为科学有效地控制与治疗由该菌引发的食物中毒提供依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
分别于2019年8、9、10月选取淄博市张店区、淄川区、周村区、桓台县市售的具有生食贝类代表性的牡蛎和毛蚶进行采样。选取超市、水产市场等作为采样地点，用随机抽样的方法对相关样品进行采集。采集牡蛎共计20份，毛蚶共计20份，具体样品采集分布情况见表1。
1.2 仪器和试剂
仪器：拍击式均质器，BAGMIXER400;恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司GHP-9160;低温离心机，Thermo MULTIFUGEXIR;核酸提取仪，苏州天隆科技有限公司;荧光定量PCR仪，美国ABI公司;VITEK 2 Compact生化鉴定仪。
试剂：3%氯化钠碱性蛋白胨水、3%氯化钠三糖铁琼脂、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，北京陆桥;弧菌显色培养基，法国科玛嘉;氧化酶试剂，bioMerieux，sa;VITEK2革兰阴性杆菌鉴定卡、副溶血性弧菌（TDH、TRH、TLH）三重核酸检测试剂盒，深圳生科原。
1.3 方法
依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》（GB 4789.7-2013）进行定量检测。
1.4 荧光定量PCR
依据《国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》进行多重PCR实验，以及毒力基因检测。结果判读：tlh基因阳性记为副溶血性弧菌阳性，tdh、trh任一基因阳性则应记为致病性副溶血性弧菌阳性。
2 结果
2.1 副溶血性弧菌毒力基因携带情况
经多重荧光PCR检测，40份贝类样品（20份牡蛎和20份毛蚶）中，副溶血性弧菌（tlh基因）阳性样品19份，阳性率47.50%（19/40），其中牡蛎阳性率为50.00%（10/20），毛蚶阳性率为45.00%（9/20）;毒力基因（tdh、trh）阳性15份，携带率37.50%（15/40），其中牡蛎携带率为45.00%（9/20），毛蚶携带率为30.00%（6/20），各毒力基因携带情况见表2。
2.2 副溶血性弧菌污染水平分析
结果显示，在检出副溶血性弧菌的19份样品中，污染量≥110MPN/g的样品占26.00%（5/19），其中牡蛎3份，毛蚶2份。在携带致病性毒力基因的15份样品中，各毒力基因的污染量及占比见表3。
2.3 不同采样地点副溶血性弧菌的检出情况
此次样品采集选取了淄博市张店区、淄川区、周村区和桓台县这4个区县进行随机采样，以张店区检出率最高，为36.84%（7/19）;淄川区次之，为31.58%（6/19）;周村区和桓台县检出率均为15.79%（3/19）。
3 讨论
现如今，实时荧光PCR方法已广泛应用于细菌的快速检测，包括霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌这5种致病性弧菌的多重PCR检测[6]。多重PCR可同时检测副溶血性弧菌的种特异基因和毒力基因（tdh和trh），即在检出副溶血性弧菌的同时判断其致病性，具有快捷、高效的特点，目前已被日本、美国等国家的食品检测机构广泛应用[7]。由检测结果可以看出，副溶血性弧菌在淄博市市售牡蛎产品中的检出率（50.00%）高于毛蚶（45.00%），毒力基因的携带率同样是牡蛎产品（45.00%）高于毛蚶（30.00%）。究其缘由，可能与牡蛎的滤食性较强有关，它可将致病性弧菌富集在体内达到107～109CFU/mL[8]。从地域分布来看，张店区的检出率在4个区县中最高（36.84%）。张店区是淄博市的中心城区，更是全市政治、经济、文化、金融和科技中心，无论是人口的密集度还是产品的销售流通量都较其他3个区县高，这可能是导致张店区检出率高的原因之一。
传统的副溶血性弧菌检验方法及手段不仅耗时长，且工作量极大，已不能满足食源性疾病中的快速诊断要求。而荧光PCR方法便捷、快速、自动化强，极大地提高了检验效率，已被越来越多的应用于检验工作中。将传统方法与PCR方法相结合，取长补短以提高检测效率，不仅能够为副溶血性弧菌的快速诊断和食源性疾病的控制提供参考依据，还可为致病弧菌的流行病学调查提供参考。
参考文献：
[1] 沙丹，管红霞，冯微宏，等.无锡市副溶血性弧菌感染的分子流行病学特征分析[J].中国病原生物学杂志，2015（7）：630-633.
[2] 郑文龙，王卓，马洁，等.副溶血性弧菌病原学和分子流行病学流行特征研究进展[J].疾病监测，2015，30（4）：337-341.
[3] Nair G B， Ramamurthy T， Bhattacharya S K， et al. Global Dissemination of Vibrio parahaemolyticus Serotype O3：K6 and Its Serovariants[J]. Clinical Microbiology Reviews， 2007， 20（1）：39.
[4] Pan T M， Wang T K， Lee C L， et al. Food-borne disease outbreaks due to bacteria in Taiwan， 1986 to 1995.[J]. Journal of Clinical Microbiology， 1997， 35（5）：1260-1262.
[5] 張冲，高翔，甄博珺，等.副溶血弧菌PFGE分型、毒力基因及其耐药性分析[J].中国卫生检验杂志，2013（4）：1015-1018.
[6] 窦勇，宁喜斌.副溶血弧菌间接ELISA快速检测法的建立[J].食品工业科技，2007（6）：205-209.
[7] 刘雪飞，申越，任园园，等.海产品中副溶血性弧菌检测方法研究进展[J].食品工业科技， 2014，35（5）：370-373.
[8] 王琪，滕勇勇，何仕雯，等.多重PCR快速检测5种重要致病性弧菌[J].中国卫生检验杂志，2014（24）：3497-3500.
基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目（2017w5562）;课题名称：副溶血性孤菌的致病性及分子学检测研究。
关键词：副溶血性弧菌 MPN定量法 多重荧光PCR法 毒力基因
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种嗜盐性革兰氏阴性菌，其普遍存在于海产品中。食用被该菌污染的食品后，人体常会出现腹泻、呕吐等胃肠道反应，严重者可发生休克[1]。据报道，近年来由副溶血性弧菌引发的食物中毒呈现出明显的上升趋势——已超过沙门氏菌位居首位[2]。在沿海省份和地市，由副溶血性弧菌导致的食源性疾病事件占总数的一半以上[3-4]。研究发现，耐热性直接溶血素（TDH）、TDH相关的溶血素（TRH）与副溶血弧菌致病性密切相关，被认为是其主要毒力因子[5]。因此，本文对2019年山东省淄博市市售生食贝类中副溶血性弧菌的污染状况和毒力基因携带情况进行了分析，以期为科学有效地控制与治疗由该菌引发的食物中毒提供依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集
分别于2019年8、9、10月选取淄博市张店区、淄川区、周村区、桓台县市售的具有生食贝类代表性的牡蛎和毛蚶进行采样。选取超市、水产市场等作为采样地点，用随机抽样的方法对相关样品进行采集。采集牡蛎共计20份，毛蚶共计20份，具体样品采集分布情况见表1。
1.2 仪器和试剂
仪器：拍击式均质器，BAGMIXER400;恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司GHP-9160;低温离心机，Thermo MULTIFUGEXIR;核酸提取仪，苏州天隆科技有限公司;荧光定量PCR仪，美国ABI公司;VITEK 2 Compact生化鉴定仪。
试剂：3%氯化钠碱性蛋白胨水、3%氯化钠三糖铁琼脂、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，北京陆桥;弧菌显色培养基，法国科玛嘉;氧化酶试剂，bioMerieux，sa;VITEK2革兰阴性杆菌鉴定卡、副溶血性弧菌（TDH、TRH、TLH）三重核酸检测试剂盒，深圳生科原。
1.3 方法
依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》（GB 4789.7-2013）进行定量检测。
1.4 荧光定量PCR
依据《国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》进行多重PCR实验，以及毒力基因检测。结果判读：tlh基因阳性记为副溶血性弧菌阳性，tdh、trh任一基因阳性则应记为致病性副溶血性弧菌阳性。
2 结果
2.1 副溶血性弧菌毒力基因携带情况
经多重荧光PCR检测，40份贝类样品（20份牡蛎和20份毛蚶）中，副溶血性弧菌（tlh基因）阳性样品19份，阳性率47.50%（19/40），其中牡蛎阳性率为50.00%（10/20），毛蚶阳性率为45.00%（9/20）;毒力基因（tdh、trh）阳性15份，携带率37.50%（15/40），其中牡蛎携带率为45.00%（9/20），毛蚶携带率为30.00%（6/20），各毒力基因携带情况见表2。
2.2 副溶血性弧菌污染水平分析
结果显示，在检出副溶血性弧菌的19份样品中，污染量≥110MPN/g的样品占26.00%（5/19），其中牡蛎3份，毛蚶2份。在携带致病性毒力基因的15份样品中，各毒力基因的污染量及占比见表3。
2.3 不同采样地点副溶血性弧菌的检出情况
此次样品采集选取了淄博市张店区、淄川区、周村区和桓台县这4个区县进行随机采样，以张店区检出率最高，为36.84%（7/19）;淄川区次之，为31.58%（6/19）;周村区和桓台县检出率均为15.79%（3/19）。
3 讨论
现如今，实时荧光PCR方法已广泛应用于细菌的快速检测，包括霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌这5种致病性弧菌的多重PCR检测[6]。多重PCR可同时检测副溶血性弧菌的种特异基因和毒力基因（tdh和trh），即在检出副溶血性弧菌的同时判断其致病性，具有快捷、高效的特点，目前已被日本、美国等国家的食品检测机构广泛应用[7]。由检测结果可以看出，副溶血性弧菌在淄博市市售牡蛎产品中的检出率（50.00%）高于毛蚶（45.00%），毒力基因的携带率同样是牡蛎产品（45.00%）高于毛蚶（30.00%）。究其缘由，可能与牡蛎的滤食性较强有关，它可将致病性弧菌富集在体内达到107～109CFU/mL[8]。从地域分布来看，张店区的检出率在4个区县中最高（36.84%）。张店区是淄博市的中心城区，更是全市政治、经济、文化、金融和科技中心，无论是人口的密集度还是产品的销售流通量都较其他3个区县高，这可能是导致张店区检出率高的原因之一。
传统的副溶血性弧菌检验方法及手段不仅耗时长，且工作量极大，已不能满足食源性疾病中的快速诊断要求。而荧光PCR方法便捷、快速、自动化强，极大地提高了检验效率，已被越来越多的应用于检验工作中。将传统方法与PCR方法相结合，取长补短以提高检测效率，不仅能够为副溶血性弧菌的快速诊断和食源性疾病的控制提供参考依据，还可为致病弧菌的流行病学调查提供参考。
参考文献：
[1] 沙丹，管红霞，冯微宏，等.无锡市副溶血性弧菌感染的分子流行病学特征分析[J].中国病原生物学杂志，2015（7）：630-633.
[2] 郑文龙，王卓，马洁，等.副溶血性弧菌病原学和分子流行病学流行特征研究进展[J].疾病监测，2015，30（4）：337-341.
[3] Nair G B， Ramamurthy T， Bhattacharya S K， et al. Global Dissemination of Vibrio parahaemolyticus Serotype O3：K6 and Its Serovariants[J]. Clinical Microbiology Reviews， 2007， 20（1）：39.
[4] Pan T M， Wang T K， Lee C L， et al. Food-borne disease outbreaks due to bacteria in Taiwan， 1986 to 1995.[J]. Journal of Clinical Microbiology， 1997， 35（5）：1260-1262.
[5] 張冲，高翔，甄博珺，等.副溶血弧菌PFGE分型、毒力基因及其耐药性分析[J].中国卫生检验杂志，2013（4）：1015-1018.
[6] 窦勇，宁喜斌.副溶血弧菌间接ELISA快速检测法的建立[J].食品工业科技，2007（6）：205-209.
[7] 刘雪飞，申越，任园园，等.海产品中副溶血性弧菌检测方法研究进展[J].食品工业科技， 2014，35（5）：370-373.
[8] 王琪，滕勇勇，何仕雯，等.多重PCR快速检测5种重要致病性弧菌[J].中国卫生检验杂志，2014（24）：3497-3500.
基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目（2017w5562）;课题名称：副溶血性孤菌的致病性及分子学检测研究。