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摘要高血压已成为全球最常见的心血管疾病，其中肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensinaldosterone system，RAAS）发挥着重要的血压调节作用，血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）催化血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，并使缓激肽失活，因此，其抑制剂成为抗高血压药物研究的靶点。许多研究表明小肽具有ACE活性抑制作用，存在调控高血壓的潜力。海洋生物种类丰富，具有潜在的生物活性肽的开发价值。对来自海洋生物的抗高血压生物活性肽的生产和构效关系（StructureActivity Relationship，SAR）的研究现状进行综述。
关键词海洋生物；ACE抑制肽；降血压；制备；构效关系
中图分类号S986.2文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-336-07
AbstractHypertension has become one of the most common cardiovascular disease， in which reninangiotensin aldosterone system（RAAS） plays an important role in regulating blood pressure. Thus， angiotensin converting enzyme （AngiotensinConverting Enzyme，ACE） inhibitors becomes the target of antihypertensive drugs. At present， many studies showed that some proteinderived peptides have ACE inhibition activity， which is the potential for regulating high blood pressure. Marine organism is rich in species and has the potential of developing bioactive peptides. In this paper， the preparation and the structureactivity relationship （SAR） of the antihypertensive bioactive peptides from Marine organisms were reviewed.
Key words Marinederived；Antihypertensive peptide； Lower blood pressure； Preparation；QSAR
根据2011年颁布的《中国高血压防治指南》，当年我国18岁以上人群高血压患病率约为20%，预测高血压患者约2 亿人，估计每年新增高血压患者1 000万人且呈年轻化趋势。高血压常引起心、脑、肾等脏器的并发症，严重威胁和危害着人类健康。全球每年有超过1 700万的人死于心血管疾病，其中由高血压并发症导致的死亡多达940万[1]，高血压成了名副其实的“沉默杀手”。目前，高血压的调控主要依赖于药物治疗和饮食控制。但是，抗高血压药物常引起头痛、眩晕、干咳和瘙痒等副作用。因此，利用天然食物资源分离抗高血压功能组分，开发调控高血压功能食品成为研究热点。
肾素-血管紧张素系统（reninangiotensin system，RAS）或肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensinaldosterone system，RAAS）在协调哺乳动物体内的血压与体液平衡中起着重要作用。其中血管紧张素转换酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）是一个羧基二肽酶，可以催化无生物活性的血管紧张素Ⅰ（Ang Ⅰ）生成具有促进血压升高作用的血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）和钝化扩张血管的舒缓激1肽（bradykinin），在调节机体血压中发挥着重要作用。因此，抑制ACE酶作用已经成为抗高血压功能组分开发的靶标。
越来越多的研究表明，在一些蛋白前体中潜藏着某些具有特殊生物活性的肽段，人们称之为生物活性肽（bioactive peptides）或者功能肽（functional peptides）。自从首次在蛇毒中发现具有抑制血管紧缩素转换酶的活性小肽以来，大量的研究业已证明很多源自食物蛋白的生物活性肽具有抗高血压作用。同时，研究发现小肽可以更好地被人体吸收和利用，改变了传统的蛋白质只能被降解成氨基酸才能被吸收利用的观点[2]。因此，抗高血压生物活性小肽的制备和活性研究已经成为抗高血压功能性食品开发热点。
海洋占据了大约71%的地球表面积，但拥有超过90%的生物圈，而其中的生物承受着生命中遇到的最极端的温度、光线和压力。适应这些恶劣的环境导致了海洋生物种类丰富性和遗传多样性。因此，利用海洋生物资源挖掘功能性组分已经渐成焦点。笔者对利用海洋生物的蛋白资源制备抗高血压生物活性肽的现状和趋势进行综述。
1生物活性肽调控血压的作用方式
1.1对血管紧张素转换酶的抑制高血压的形成与很多因素相关，如年龄、性别、社会经济地位、家庭高血压史、体重指数、腰臀比、生活方式和膳食结构等。目前，经典的血压调节机制认为RAS或RAAS在协调人体内的血压与体液平衡中起着重要作用。在RAS系统中，肝脏分泌的血管紧张素原（angiotensinogen，Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–HisPro–Phe–His–Leu–Val–Tyr–Ser–R），经肾脏分泌的天冬氨酸蛋白酶——肾素催化水解LeuVal之间的肽键产生无生理活性的Ang Ⅰ（Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–His–Pro–Phe–His–Leu）。Ang Ⅰ经血管内皮的ACE作用，C-末端氨基酸残基HisLeu被水解，形成Ang Ⅱ（Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–His–Pro–Phe）[3]。Ang Ⅱ能够刺激血管的收缩和促进肾上腺皮质分泌醛固酮，导致血压升高[3]。此外，缓激肽在血压调节中也发挥着重要作用。缓激肽是主要由肝脏和肾脏分泌的激肽原在激肽释放酶的作用下形成的一种血管扩张因子，但它C-末端的PheArg可以被ACE水解丢失而导致活性丧失[4]。目前尚未发现海洋生物源小肽具有肾素活性抑制作用，因此ACE成为众多海洋生物源调节高血压小分子物质开发的靶标。 目前，海洋生物源抗高血压肽（表1）对ACE的抑制作用方式主要分为竞争性抑制和非竞争性抑制。已发现的ACE竞争性抑制作用小肽有FCVLRP[14]、IFVPAF[14]、KPPETV[14]、VEGY[18]、DDTGHDFEDTGEAM[21]、LF[22]、WA[22]、WV[22]、WM[22]、MF[26]、RY[26]、LY[26]、YL[26]、KW[26]和RVY[26]；ACE非竞争性抑制作用的小肽有VWDPPKFD[7]、WPEAAELMMEVDP[8]、MIFPGAGGPEL[9]、GDLGKTTTVSNWSPPKYKDTP[10]、VECYGPNRPQF[19]、FL[22]、AW[22]、MW[22]、IW[22]、LW[22]、WL[22]、FGASTRGA[29]、LLMLDNDLPP[30]、VVYPWTQRF[33]、AHSY[37]和AMN[44]等。
同时，一些海洋生物源小肽兼具ACE竞争性和非竞争性抑制作用，如FEDYVPLSCF[7]和 FNVPLYE[7]，人们认为此类小肽可能是作为前体型抑制剂存在，它们被ACE水解后才产生真正的ACE抑制肽。此外，Seigo Ono等发现的VW具有反抑制作用[22]，它通过与ACE酶和作用底物形成的复合物结合，抑制底物的水解，从而达到减少Ang Ⅱ的生成、调节血管的舒张的作用。
1.2对高血压相关基因的转录调控血压的调节还与体内氧化应激途径和Ca2+＼Na+＼K+的离子平衡相关，它们都受到一些基因的调控[5-7]。Pfeffer等发现，经过50 μg的EGCG处理的人脐带静脉血管内皮细胞中65个基因转录被特异性地上调或下调，他们认为这些基因可能参与信号传导途径，进一步影响血管舒张功能参与血压调节[45]。Qian 等也发现，合成小肽IVP、VIP、IPP、IPPVPP和VPPIPP等能够上调心肌肌浆网Ca2+-ATP酶基因（SERCA 2a）的转录水平[46-47]。SERCA可以促进细胞内钙离子的吸收，从而舒张血管平滑肌和心肌，导致血压的下降。但是，目前关于海洋生物源抗高血压生物活性肽是否能够促进或抑制这类基因的转录尚未见相关报道。
2生物活性肽的抗高血压活性的检测方法
目前，生物活性肽的抗高血压活性的检测方法主要分为体外（in vitro）分析和体内（in vivo）分析。
2.1体外ACE活性抑制分析方法体外分析主要是根据RAS途径，评价小肽的ACE酶抑制活性和作用方式。在ACE活性抑制试验体系中，常用底物为HipHis Leu （HHL）[48]和N[3（2furylacryloyl）]L PheGlyGly （FAPGG）[49]。HHL是模拟Ang Ⅰ的C-末端氨基酸残基的合成物，其在ACE的作用下能够水解成马尿酸（Hippuric Acid，HA）和二肽HisLeu （HL）。HA在乙酸乙酯中具有较好的溶解特性并且在228 nm波长的紫外光下具有较强的吸收特征，而绝大多数的小肽具有较好的水溶性，因此可以通过乙酸乙酯萃取反应终产物中HA，挥发后定容至一定体积，通过228 nm波长紫外光下光密度值（OD）来推演抑制剂对ACE的抑制作用。基于此原理，Cushman等提出ACE活性抑制分析紫外分光光度法并被广泛引用[8]。但是，乙酸乙酯存在对HA的萃取不完全、对HHL和弱疏水性肽的非选择性、挥发残留及在228 nm波长下HHL和乙酸乙酯同样具有吸收特征等特点，导致此方法精度低且耗时。针对此方法的缺陷，Matsui等和Li等分别建立ACE活性抑制可见分光光度方法，它省略了HA的分离步骤，具有直接、灵敏、准确、重现性好等优点[50-51]。该法基于三硝基苯磺酸（TNBS）与HL特异性结合生成在416 nm可见光波长下具有特征吸收峰的TNPHL衍生物和在喹啉辅助下苯磺酰氯与HA特异性结合生成的在492 nm波长的可见光下具有特征吸收峰的喹啉-苯磺酰氯HA发色体。为了进一步提高分析的精确性，尤其是对痕量样品的分析，Wu 等建立了利用RPHPLC分析ACE水解HHL所生成的HA的检测方法[50]，现在这一方法已经取代了分光光度法，被广泛应用。
另外，有研究人员建立了以FAPGG为作用底物的ACE活性抑制分析分光光度法[49]。ACE可以将呈蓝色的N （3 [2furylacryloyl） PheGlyGly水解成2furylacryloylLPhe和GlyGly，使蓝光在340 nm发生在迁移。通过连续检测340 nm波长下吸光值的下降速度可以计算ACE活性。这一方法因省略了从反应产物中分离HA的过程，具有简单、灵敏和高效的特点。Sentandreu等建立了ACE活性抑制分析荧光光度法[53]。它是基于ACE可以将分子内淬灭的荧光底物
Oaminobenzoylglycylpnitrophenylalanylproline（ABzGlyPhe（NO2）Pro） 水解释放出荧光分子Abz–Gly，通过荧光酶标仪测定荧光信号的强弱，进而分析样品对ACE活性的抑制作用。该方法因为使用试剂单一，可满足大量样品的筛选需求。
无论是紫外-可见光光度法，还是RPHPLC方法，它们分析样本的能力依然存在不足，难以适应大量样品筛选的高通量需求。Zhang 等建立了利用毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）直接分析ACE活性的方法[54]。这一方法仍然是基于HHL可以被ACE水解为HA和HL。CE法具有更快捷、样品底物和ACE用量少，自动化程度更高等优点，已经被应用于ACE活性抑制肽的高通量筛选[55]。
ACE抑制劑（ACEI）对ACE活性的抑制效果一般采用某一浓度下的抑制率和IC502种方式表示。通常分析样品的ACE抑制作用动力学呈非线性的对数曲线，因此抑制率表示虽然简单快捷，但不能比较不同水解物间ACE抑制活性的大小。而IC50是抑制ACE 50%活性时所需要的ACE抑制剂浓度，被广泛地应用于指征样品的ACE活性抑制能力。 2.2体内血压调控分析方法从体外ACE抑制活性和胃肠道模拟消化分析获得的信息仅表明小肽为潜在的体内降低血压的制剂。小肽生理功能的体现需要它能够耐受在胃肠道和血管系统中消化和改变，以活性形式到达靶标位点。因此，抗高血压肽还需要进行体内分析。生物活性肽的抗高血压活性体内分析主要采用模式动物——自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）。SHR是Okamoto和Aoki（1959）采用高血压（SBP，150～175 mmHg）的雄性WistarKyoto（WKY）大鼠与雌性WKY大鼠（SBP，130～140 mmHg）交配得到高血压子代（SBP，>150 mmHg），再选用血压较高的大鼠进行选择性近亲交配20代后获得稳定的高血压遗传性。通过口服或者静脉注射生物活性肽，通过尾袖法连续测量喂食后的SHR尾大鼠尾动脉血压，以收缩压（SBP）的变化来衡量生物活性肽的降压效果。在体内分析中，通常以正常血压的WKY大鼠作正常对照组[56]，但是WKY的自发性高血压发生率较高，被认为不适合作为对照组使用。因此，在体内抗高血压分析中，通常以溶剂作为空白组，以抗高血压药物Captopril作为阳性对照组，比较分析生物活性肽的体内降压能力，不再设置正常血压WKY作为正常对照组。另一种方法是先给原發性高血压大鼠静脉注射六甲铵（一种降压药），以去除大鼠中不依赖于RAS血压调节系统的影响，然后再静脉注射ACE抑制肽和AngI，根据SHR的血压变化来评价ACE抑制肽的血压调控作用[57]。
3海洋抗高血压生物活性肽的制备及活性
目前，制备抗高血压生物活性肽常用的方法主要有蛋白酶解法[5-15，17-24，26-30，33-41，43-44]和微生物发酵法[16]（表1）。蛋白酶水解法不仅可以根据抗高血压生物活性肽的构效关系，选择蛋白酶的种类，定向制备抗高血压生物活性肽，提高生产效率；而且可以水解破坏过敏源蛋白的表位以降低甚至消除其致敏性，提高食用安全性，扩大适用人群。因此，该方法已经被广泛应用于海洋生物源抗高血压生物活性肽的制备[5-15，17-24，26-30，33-41，43-44]。在蛋白酶水解体系中采用的蛋白酶主要有工业食品级蛋白酶，如碱性蛋白酶[7，13]；微生物来源的复合蛋白酶，如嗜热菌蛋白酶[5，34]；Bacillus licheniformis的碱性蛋白酶[6，26]、Bacillus sp. SM98011的蛋白酶SM98011[11，14]、链霉蛋白酶E[28]、Protamex[35]、Bacillus. Mojavensis A21粗制蛋白酶[36，37]等；植物来源的蛋白酶，如木瓜蛋白酶[12，23]、菠萝蛋白酶[34，40]、胶原酶[28]；以及动物来源的蛋白酶，如胃蛋白酶[8，10，15，19-20，29-30，42-43]、胰凝乳蛋白酶[30]、胰蛋白酶[30，41]和乌贼肝胰腺粗制蛋白酶[36]等。在这些蛋白酶中，应用最为广泛的为胃蛋白酶和胰蛋白酶，这主要归因于利用它们制备获得的抗高血压活性肽能够耐受体内消化，从而增加生物利用度，同时所制得活性肽的体外活性与体内活性之间存在较好的相关性。
在生产抗高血压活性肽的发酵制备工艺中，主要采用的Lactobacillus fermentum SM 605微生物发酵[16]，或采用25%NaCl腌制发酵成熟[25，31-32]。除此之外，酸水解法亦被应用于抗高血压生物活性肽的制备[42]。
现有制备抗高血压活性肽的海洋生物种类丰富，包含了鱼类（如：麻哈鱼、三文鱼、金枪鱼、鳕鱼、鲨鱼、海龙、海鲷、凤尾鱼、沙丁鱼、鲣鱼、鲻、鲹鱼、斑鳐等），虾类（如：中国毛虾[14-16]）、软体动物类（如：紫贻贝、文蛤、蛤蜊、珍珠贝、鲍、海参、乌贼等），藻类（如裙带菜、海藻、小球藻等）和浮游生物类（如：臂尾轮虫[21]）等。主要利用其肌肉蛋白进行水解[5，8，11，13，22，26-27，35-39]，其他水解和发酵部分包括整虾粉碎物、骨架蛋白、蛋白废弃物、皮、鳞和生殖腺[7，9-10，12，28-30，42]等。
在获得抗高血压活性肽的研究过程中（表1），Wu 等利用来源于Bacillus sp. SM98011的蛋白酶SM98011水解鲨鱼肌肉蛋白获得二肽MF，其ACE活性抑制IC50为0.92 μmol/L，为已报道ACE抑制活性最高的小肽[11]。但是，Matsufuji等利用来源于Bacillus licheniformis的碱性蛋白酶水解沙丁鱼肌肉蛋白，同样获得二肽MF，而其ACE活性抑制IC50为44.7 μmol/L，远比前者活性低[26]。笔者认为这可能与他们采用的ACE活性抑制分析方法不同造成，Wu等采用的是毛细管电泳法，而Matsufuji等采用的是TNBS比色法，也可能与不同的制备方法获得的二肽构象上的差异相关。Suetsuna等利用胃蛋白酶水解裙带菜，获得四肽YKYY，其体外ACE活性抑制IC50为64.2 μmol/L，SHR口服YKYY（50 mg/kg BW）1 h后，收缩压下降大约50 mmHg[20]。而Suetsuna等同时获得的四肽YNKL的体外ACE活性抑制IC50为21 μmol/L，为YKYY活性的3倍，但是SHR口服相同剂量的YNKL 2 h后，其收缩压降低效果与YKYY的降压效果没有显著差异[20]。这可能是因为体内消化环境使这2个四肽发生进一步的水解，造成活性的改变，也可能是由于YKYY在体内除了通过RAS系统调节血压之外，还通过其他途径调节血压，如：氧化应激和基因转录调控等。另外，YKYY和YNKL是已报道的抗高血压肽中体内降压效果最好的2个小肽，具有较好的商业化前景。
4海洋抗高血压生物活性肽的构效关系
目前，有关活性肽的ACE抑制活性与其结构之间的关系已经进行了一些研究，但是单纯的海洋生物源生物活性肽的ACE抑制活性与其结构之间的确切关系尚未见系统研究。基于已有的研究结果，笔者发现海洋生物源生物活性肽的ACE抑制活性与其分子量、氨基酸的种类和排列顺序以及肽的构象有密切的关系。 4.1分子质量对抗高血压肽活性的影响分子量是生物活性肽活性功能体现的最重要的影响因子之一。从海洋生物蛋白中制备获得ACE抑制活性肽的分子量范圍为2～21个氨基酸组成（表1）。在统计的72个明确了ACE活性抑制IC50的2～3肽的ACE活性抑制IC50中位数为51 μmol/L，而58个明确了ACE活性抑制IC50的4～21肽的ACE活性抑制IC50中位数为38.25 μmol/L。这并不能说明小肽的分子量的大小与其ACE抑制活性之间存在必然的相关性，例如Lee等利用胃蛋白酶水解金枪鱼骨架蛋白制备获得21肽GDLGKTTTVSNWSPPKY KDTP的ACE活性抑制IC50为11.28 μmol/L[10]；Wu 等利用来源于Bacillus sp. SM98011的蛋白酶SM98011水解鲨鱼肌肉蛋白获得二肽MF，其ACE活性抑制IC50为0.92 μmol/L[11]；而Yokoyama等利用嗜热菌蛋白酶水解干燥的鲣鱼肌肉蛋白制备获得5肽LKPNM，其ACE活性抑制IC50为17 μmol/L[27]。后来，Fujita等发现LKPNM被ACE水解后的LKP的ACE抑制活性是LKPNM的8倍[58]。这说明生物活性肽活性可能与肽的氨基酸组成有关。
4.2氨基酸组成和一级结构对抗高血压肽活性的影响研究表明，生物活性肽的ACE抑制活性与其氨基酸的组成具有很高的相关性，这可能是由这些组成氨基酸的结构特征决定的。关于ACE抑制活性肽的QSAR研究表明，组成小肽的氨基酸的分子质量、拓扑结构、疏水性、电荷和静电特征等是影响其活性的关键变量[59]。具有较高ACE抑制活性的2～3肽的C-末端通常是Tyr、Phe、Trp或Pro，其N-末端通常为Val、Lue和Ile等脂肪族支链氨基酸[60-61]。Ono等和Enari等利用嗜热菌蛋白酶和胃蛋白酶水解大马哈鱼肌肉蛋白制备获得ACE抑制活性较高的2肽LW[5]、IW[5]、MW[5]、VW[5]、AW[22]、IW[23]和LW[23]等的C-末端均为Trp残基，相对活性较高的小肽N-末端都含有Val、Lue和Ile残基，且对活性的影响Val>Ile>Lue。这可能与芳香族氨基酸的疏水性以及Trp的正电荷特性相关[59]。Toshiaki等从凤尾鱼、沙丁鱼和鲣鱼酱中分离获得ACE抑制活性较高的2～3肽的C-末端均为Pro残基，如AP、KP、和RP[25]。此外，ACE抑制活性肽中Pro残基的存在，尤其是C-末端的Pro，具有耐受消化酶降解的特点，能够提高其体内的生物利用度，更有机会以完整形式作用于其靶标。
即使小肽的氨基酸组成相同，氨基酸排列顺序的不同也对其ACE抑制活性和抑制方式具有重要的影响。Ono等利用嗜热菌蛋白酶水解大马哈鱼肌肉蛋白制备获得2个二肽MW和WM，其中MW的ACE抑制活性是WM的10倍，且MW的抑制方式是非竞争性抑制而WM为竞争性抑制[5]；同样的另外2个二肽VW和WV，前者的ACE抑制活性是后者200倍，且前者的作用方式为反抑制作用，后者为竞争性抑制[5]。Ono等同样利用嗜热菌蛋白酶水解马苏大马哈鱼肌肉蛋白获得2个二肽FL和LF，其中FL的ACE抑制活性是LF的28倍，且前者的抑制方式为非竞争性，后者为竞争性抑制[22]。同时，他们获得另外2对二肽LY和YL以及LW和WL，虽然它们之间的ACE抑制活性相差2倍左右，但其抑制方式一致，分别为竞争性抑制和非竞争性抑制。笔者发现，氨基酸组成相同但顺序不同的小肽之间ACE抑制活性差异越大，其抑制方式越可能不同，这可能与顺序差异导致小肽的拓扑结构的改变相关联，尤其是在较大分子量的小肽中表现更为显著[62]。
5海洋抗高血压肽的商业化状况
在日本，一些含有海水鱼蛋白水解物/肽为功能成分的特定保健用食品（Food for Specified Health Uses，FOSHU）已经获准商业化，这些产品均宣称适合轻度高血压人群消费，如Lapis SupportTM和Valtyron。两者都是以沙丁鱼的蛋白水解产物为主要功能成分，其中Lapis SupportTM是以饮料的形式售卖，而Valtyron却以33种产品形式售卖，包括饮料、果冻、汤料粉和膳食补充剂等[63]。另外一个被准允商业化的产品是利用嗜热菌蛋白酶水解鲣鱼形成的抗高血压肽速溶粉汤料，其主要功能成分为抗高血压活性肽LKPNM，它可以显著降低轻度高血压患者的收缩压。除了以饮料产品售卖外，在日本鲣鱼肽也以粉剂和片剂形式售卖，如Peptide ACE 3000。这些鲣鱼肽片剂在美国和加拿大均有销售，其商品名称分别为Vasotensin和Levenorm[63]。
6海洋抗高血压肽的应用前景与研究展望
虽然ACE活性抑制肽相对于常规的抗高血压药物存在剂量效应上的弱势，但是抗高血压药物通常具有一些副作用，如造成干咳、瘙痒等。然而，ACE活性抑制肽来源于天然的蛋白质，作用温和、安全没有副作用，可以每天食用。同时，一些ACE活性抑制肽还具有多重的生物学效应，如抗氧化和抗炎症等[64]，使之可能成为抗高血压药物日常替代品。海洋环境的生物多样性和特殊性造就了海洋生物蛋白质的组成和氨基酸序列与陆生生物的蛋白具有较大的差异性，蕴含着丰富的生物活性肽资源。利用海洋生物蛋白或废弃物料制备抗高血压肽具有较好的应用前景。
但是，目前抗高血压肽的生产工艺主要是通过体外蛋白酶水解或食品加工（主要是利用食品级微生物发酵处理）。由于通常采用的是复合酶消化水解蛋白和多种微生物进行发酵处理，所以生产的活性肽都是复杂的混合物。而且对完整大分子蛋白质的水解能力较差，水解程度较低，水解产物粘度较大，这些局限性导致了抗高血压肽的得率很低，不适合规模化生产。同时，利用RPHPLC等技术从复杂的生物活性肽混合物中分离出目的活性肽过程繁杂，且缺乏高通量的活性鉴定技术体系。因此，这种高成本、低重复性和低生物利用率的体外酶解消化生产生物活性肽的生产工艺迫切需要发展一种新的替代生产技术。同时，由于二肽和三肽具有耐受体内消化酶的作用、易被吸收和易向合成药物转化等特点，所以在海洋生物源抗高血压肽的筛选和鉴定研究中，人们更应该关注2～3个氨基酸组成抗高血肽的挖掘。 目前不同的研究中采用的ACE抑制活性分析試验方法体系存在差异，如紫外分光度法、可见光分光光度法、荧光分析法、毛细管电泳法和色谱法等，使得不同实验室间的结果很难进行直接的比较分析。因此，建立ACE抑制活性分析的标准方法体系十分重要，这样有助于建立一个科学的、可参考的海洋生物源抗高血压生物活性肽库，方便开展抗高血压肽的结构与效应关系的解析。通过构建的抗高血压肽的构效关系，利用生物信息学方法，建立抗高血压肽的靶向生产方式也十分重要。
此外，抗高血压肽活性的体现具有食品体系的依赖性。不同的食品体系对其稳定性和体内的生物利用率具有影响。因此，采用更准确的接近目标食物和生物体系的模拟体系来进行活性分析尤为重要。同时，突围现有的研究仍然停留在体外化学分析的局限，通过设计巧妙的动物体内试验和人类临床研究进一步评估其健康促进作用和潜在的风险也需要予以关注。
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关键词海洋生物；ACE抑制肽；降血压；制备；构效关系
中图分类号S986.2文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-336-07
AbstractHypertension has become one of the most common cardiovascular disease， in which reninangiotensin aldosterone system（RAAS） plays an important role in regulating blood pressure. Thus， angiotensin converting enzyme （AngiotensinConverting Enzyme，ACE） inhibitors becomes the target of antihypertensive drugs. At present， many studies showed that some proteinderived peptides have ACE inhibition activity， which is the potential for regulating high blood pressure. Marine organism is rich in species and has the potential of developing bioactive peptides. In this paper， the preparation and the structureactivity relationship （SAR） of the antihypertensive bioactive peptides from Marine organisms were reviewed.
Key words Marinederived；Antihypertensive peptide； Lower blood pressure； Preparation；QSAR
根据2011年颁布的《中国高血压防治指南》，当年我国18岁以上人群高血压患病率约为20%，预测高血压患者约2 亿人，估计每年新增高血压患者1 000万人且呈年轻化趋势。高血压常引起心、脑、肾等脏器的并发症，严重威胁和危害着人类健康。全球每年有超过1 700万的人死于心血管疾病，其中由高血压并发症导致的死亡多达940万[1]，高血压成了名副其实的“沉默杀手”。目前，高血压的调控主要依赖于药物治疗和饮食控制。但是，抗高血压药物常引起头痛、眩晕、干咳和瘙痒等副作用。因此，利用天然食物资源分离抗高血压功能组分，开发调控高血压功能食品成为研究热点。
肾素-血管紧张素系统（reninangiotensin system，RAS）或肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensinaldosterone system，RAAS）在协调哺乳动物体内的血压与体液平衡中起着重要作用。其中血管紧张素转换酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）是一个羧基二肽酶，可以催化无生物活性的血管紧张素Ⅰ（Ang Ⅰ）生成具有促进血压升高作用的血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）和钝化扩张血管的舒缓激1肽（bradykinin），在调节机体血压中发挥着重要作用。因此，抑制ACE酶作用已经成为抗高血压功能组分开发的靶标。
越来越多的研究表明，在一些蛋白前体中潜藏着某些具有特殊生物活性的肽段，人们称之为生物活性肽（bioactive peptides）或者功能肽（functional peptides）。自从首次在蛇毒中发现具有抑制血管紧缩素转换酶的活性小肽以来，大量的研究业已证明很多源自食物蛋白的生物活性肽具有抗高血压作用。同时，研究发现小肽可以更好地被人体吸收和利用，改变了传统的蛋白质只能被降解成氨基酸才能被吸收利用的观点[2]。因此，抗高血压生物活性小肽的制备和活性研究已经成为抗高血压功能性食品开发热点。
海洋占据了大约71%的地球表面积，但拥有超过90%的生物圈，而其中的生物承受着生命中遇到的最极端的温度、光线和压力。适应这些恶劣的环境导致了海洋生物种类丰富性和遗传多样性。因此，利用海洋生物资源挖掘功能性组分已经渐成焦点。笔者对利用海洋生物的蛋白资源制备抗高血压生物活性肽的现状和趋势进行综述。
1生物活性肽调控血压的作用方式
1.1对血管紧张素转换酶的抑制高血压的形成与很多因素相关，如年龄、性别、社会经济地位、家庭高血压史、体重指数、腰臀比、生活方式和膳食结构等。目前，经典的血压调节机制认为RAS或RAAS在协调人体内的血压与体液平衡中起着重要作用。在RAS系统中，肝脏分泌的血管紧张素原（angiotensinogen，Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–HisPro–Phe–His–Leu–Val–Tyr–Ser–R），经肾脏分泌的天冬氨酸蛋白酶——肾素催化水解LeuVal之间的肽键产生无生理活性的Ang Ⅰ（Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–His–Pro–Phe–His–Leu）。Ang Ⅰ经血管内皮的ACE作用，C-末端氨基酸残基HisLeu被水解，形成Ang Ⅱ（Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–His–Pro–Phe）[3]。Ang Ⅱ能够刺激血管的收缩和促进肾上腺皮质分泌醛固酮，导致血压升高[3]。此外，缓激肽在血压调节中也发挥着重要作用。缓激肽是主要由肝脏和肾脏分泌的激肽原在激肽释放酶的作用下形成的一种血管扩张因子，但它C-末端的PheArg可以被ACE水解丢失而导致活性丧失[4]。目前尚未发现海洋生物源小肽具有肾素活性抑制作用，因此ACE成为众多海洋生物源调节高血压小分子物质开发的靶标。 目前，海洋生物源抗高血压肽（表1）对ACE的抑制作用方式主要分为竞争性抑制和非竞争性抑制。已发现的ACE竞争性抑制作用小肽有FCVLRP[14]、IFVPAF[14]、KPPETV[14]、VEGY[18]、DDTGHDFEDTGEAM[21]、LF[22]、WA[22]、WV[22]、WM[22]、MF[26]、RY[26]、LY[26]、YL[26]、KW[26]和RVY[26]；ACE非竞争性抑制作用的小肽有VWDPPKFD[7]、WPEAAELMMEVDP[8]、MIFPGAGGPEL[9]、GDLGKTTTVSNWSPPKYKDTP[10]、VECYGPNRPQF[19]、FL[22]、AW[22]、MW[22]、IW[22]、LW[22]、WL[22]、FGASTRGA[29]、LLMLDNDLPP[30]、VVYPWTQRF[33]、AHSY[37]和AMN[44]等。
同时，一些海洋生物源小肽兼具ACE竞争性和非竞争性抑制作用，如FEDYVPLSCF[7]和 FNVPLYE[7]，人们认为此类小肽可能是作为前体型抑制剂存在，它们被ACE水解后才产生真正的ACE抑制肽。此外，Seigo Ono等发现的VW具有反抑制作用[22]，它通过与ACE酶和作用底物形成的复合物结合，抑制底物的水解，从而达到减少Ang Ⅱ的生成、调节血管的舒张的作用。
1.2对高血压相关基因的转录调控血压的调节还与体内氧化应激途径和Ca2+＼Na+＼K+的离子平衡相关，它们都受到一些基因的调控[5-7]。Pfeffer等发现，经过50 μg的EGCG处理的人脐带静脉血管内皮细胞中65个基因转录被特异性地上调或下调，他们认为这些基因可能参与信号传导途径，进一步影响血管舒张功能参与血压调节[45]。Qian 等也发现，合成小肽IVP、VIP、IPP、IPPVPP和VPPIPP等能够上调心肌肌浆网Ca2+-ATP酶基因（SERCA 2a）的转录水平[46-47]。SERCA可以促进细胞内钙离子的吸收，从而舒张血管平滑肌和心肌，导致血压的下降。但是，目前关于海洋生物源抗高血压生物活性肽是否能够促进或抑制这类基因的转录尚未见相关报道。
2生物活性肽的抗高血压活性的检测方法
目前，生物活性肽的抗高血压活性的检测方法主要分为体外（in vitro）分析和体内（in vivo）分析。
2.1体外ACE活性抑制分析方法体外分析主要是根据RAS途径，评价小肽的ACE酶抑制活性和作用方式。在ACE活性抑制试验体系中，常用底物为HipHis Leu （HHL）[48]和N[3（2furylacryloyl）]L PheGlyGly （FAPGG）[49]。HHL是模拟Ang Ⅰ的C-末端氨基酸残基的合成物，其在ACE的作用下能够水解成马尿酸（Hippuric Acid，HA）和二肽HisLeu （HL）。HA在乙酸乙酯中具有较好的溶解特性并且在228 nm波长的紫外光下具有较强的吸收特征，而绝大多数的小肽具有较好的水溶性，因此可以通过乙酸乙酯萃取反应终产物中HA，挥发后定容至一定体积，通过228 nm波长紫外光下光密度值（OD）来推演抑制剂对ACE的抑制作用。基于此原理，Cushman等提出ACE活性抑制分析紫外分光光度法并被广泛引用[8]。但是，乙酸乙酯存在对HA的萃取不完全、对HHL和弱疏水性肽的非选择性、挥发残留及在228 nm波长下HHL和乙酸乙酯同样具有吸收特征等特点，导致此方法精度低且耗时。针对此方法的缺陷，Matsui等和Li等分别建立ACE活性抑制可见分光光度方法，它省略了HA的分离步骤，具有直接、灵敏、准确、重现性好等优点[50-51]。该法基于三硝基苯磺酸（TNBS）与HL特异性结合生成在416 nm可见光波长下具有特征吸收峰的TNPHL衍生物和在喹啉辅助下苯磺酰氯与HA特异性结合生成的在492 nm波长的可见光下具有特征吸收峰的喹啉-苯磺酰氯HA发色体。为了进一步提高分析的精确性，尤其是对痕量样品的分析，Wu 等建立了利用RPHPLC分析ACE水解HHL所生成的HA的检测方法[50]，现在这一方法已经取代了分光光度法，被广泛应用。
另外，有研究人员建立了以FAPGG为作用底物的ACE活性抑制分析分光光度法[49]。ACE可以将呈蓝色的N （3 [2furylacryloyl） PheGlyGly水解成2furylacryloylLPhe和GlyGly，使蓝光在340 nm发生在迁移。通过连续检测340 nm波长下吸光值的下降速度可以计算ACE活性。这一方法因省略了从反应产物中分离HA的过程，具有简单、灵敏和高效的特点。Sentandreu等建立了ACE活性抑制分析荧光光度法[53]。它是基于ACE可以将分子内淬灭的荧光底物
Oaminobenzoylglycylpnitrophenylalanylproline（ABzGlyPhe（NO2）Pro） 水解释放出荧光分子Abz–Gly，通过荧光酶标仪测定荧光信号的强弱，进而分析样品对ACE活性的抑制作用。该方法因为使用试剂单一，可满足大量样品的筛选需求。
无论是紫外-可见光光度法，还是RPHPLC方法，它们分析样本的能力依然存在不足，难以适应大量样品筛选的高通量需求。Zhang 等建立了利用毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）直接分析ACE活性的方法[54]。这一方法仍然是基于HHL可以被ACE水解为HA和HL。CE法具有更快捷、样品底物和ACE用量少，自动化程度更高等优点，已经被应用于ACE活性抑制肽的高通量筛选[55]。
ACE抑制劑（ACEI）对ACE活性的抑制效果一般采用某一浓度下的抑制率和IC502种方式表示。通常分析样品的ACE抑制作用动力学呈非线性的对数曲线，因此抑制率表示虽然简单快捷，但不能比较不同水解物间ACE抑制活性的大小。而IC50是抑制ACE 50%活性时所需要的ACE抑制剂浓度，被广泛地应用于指征样品的ACE活性抑制能力。 2.2体内血压调控分析方法从体外ACE抑制活性和胃肠道模拟消化分析获得的信息仅表明小肽为潜在的体内降低血压的制剂。小肽生理功能的体现需要它能够耐受在胃肠道和血管系统中消化和改变，以活性形式到达靶标位点。因此，抗高血压肽还需要进行体内分析。生物活性肽的抗高血压活性体内分析主要采用模式动物——自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）。SHR是Okamoto和Aoki（1959）采用高血压（SBP，150～175 mmHg）的雄性WistarKyoto（WKY）大鼠与雌性WKY大鼠（SBP，130～140 mmHg）交配得到高血压子代（SBP，>150 mmHg），再选用血压较高的大鼠进行选择性近亲交配20代后获得稳定的高血压遗传性。通过口服或者静脉注射生物活性肽，通过尾袖法连续测量喂食后的SHR尾大鼠尾动脉血压，以收缩压（SBP）的变化来衡量生物活性肽的降压效果。在体内分析中，通常以正常血压的WKY大鼠作正常对照组[56]，但是WKY的自发性高血压发生率较高，被认为不适合作为对照组使用。因此，在体内抗高血压分析中，通常以溶剂作为空白组，以抗高血压药物Captopril作为阳性对照组，比较分析生物活性肽的体内降压能力，不再设置正常血压WKY作为正常对照组。另一种方法是先给原發性高血压大鼠静脉注射六甲铵（一种降压药），以去除大鼠中不依赖于RAS血压调节系统的影响，然后再静脉注射ACE抑制肽和AngI，根据SHR的血压变化来评价ACE抑制肽的血压调控作用[57]。
3海洋抗高血压生物活性肽的制备及活性
目前，制备抗高血压生物活性肽常用的方法主要有蛋白酶解法[5-15，17-24，26-30，33-41，43-44]和微生物发酵法[16]（表1）。蛋白酶水解法不仅可以根据抗高血压生物活性肽的构效关系，选择蛋白酶的种类，定向制备抗高血压生物活性肽，提高生产效率；而且可以水解破坏过敏源蛋白的表位以降低甚至消除其致敏性，提高食用安全性，扩大适用人群。因此，该方法已经被广泛应用于海洋生物源抗高血压生物活性肽的制备[5-15，17-24，26-30，33-41，43-44]。在蛋白酶水解体系中采用的蛋白酶主要有工业食品级蛋白酶，如碱性蛋白酶[7，13]；微生物来源的复合蛋白酶，如嗜热菌蛋白酶[5，34]；Bacillus licheniformis的碱性蛋白酶[6，26]、Bacillus sp. SM98011的蛋白酶SM98011[11，14]、链霉蛋白酶E[28]、Protamex[35]、Bacillus. Mojavensis A21粗制蛋白酶[36，37]等；植物来源的蛋白酶，如木瓜蛋白酶[12，23]、菠萝蛋白酶[34，40]、胶原酶[28]；以及动物来源的蛋白酶，如胃蛋白酶[8，10，15，19-20，29-30，42-43]、胰凝乳蛋白酶[30]、胰蛋白酶[30，41]和乌贼肝胰腺粗制蛋白酶[36]等。在这些蛋白酶中，应用最为广泛的为胃蛋白酶和胰蛋白酶，这主要归因于利用它们制备获得的抗高血压活性肽能够耐受体内消化，从而增加生物利用度，同时所制得活性肽的体外活性与体内活性之间存在较好的相关性。
在生产抗高血压活性肽的发酵制备工艺中，主要采用的Lactobacillus fermentum SM 605微生物发酵[16]，或采用25%NaCl腌制发酵成熟[25，31-32]。除此之外，酸水解法亦被应用于抗高血压生物活性肽的制备[42]。
现有制备抗高血压活性肽的海洋生物种类丰富，包含了鱼类（如：麻哈鱼、三文鱼、金枪鱼、鳕鱼、鲨鱼、海龙、海鲷、凤尾鱼、沙丁鱼、鲣鱼、鲻、鲹鱼、斑鳐等），虾类（如：中国毛虾[14-16]）、软体动物类（如：紫贻贝、文蛤、蛤蜊、珍珠贝、鲍、海参、乌贼等），藻类（如裙带菜、海藻、小球藻等）和浮游生物类（如：臂尾轮虫[21]）等。主要利用其肌肉蛋白进行水解[5，8，11，13，22，26-27，35-39]，其他水解和发酵部分包括整虾粉碎物、骨架蛋白、蛋白废弃物、皮、鳞和生殖腺[7，9-10，12，28-30，42]等。
在获得抗高血压活性肽的研究过程中（表1），Wu 等利用来源于Bacillus sp. SM98011的蛋白酶SM98011水解鲨鱼肌肉蛋白获得二肽MF，其ACE活性抑制IC50为0.92 μmol/L，为已报道ACE抑制活性最高的小肽[11]。但是，Matsufuji等利用来源于Bacillus licheniformis的碱性蛋白酶水解沙丁鱼肌肉蛋白，同样获得二肽MF，而其ACE活性抑制IC50为44.7 μmol/L，远比前者活性低[26]。笔者认为这可能与他们采用的ACE活性抑制分析方法不同造成，Wu等采用的是毛细管电泳法，而Matsufuji等采用的是TNBS比色法，也可能与不同的制备方法获得的二肽构象上的差异相关。Suetsuna等利用胃蛋白酶水解裙带菜，获得四肽YKYY，其体外ACE活性抑制IC50为64.2 μmol/L，SHR口服YKYY（50 mg/kg BW）1 h后，收缩压下降大约50 mmHg[20]。而Suetsuna等同时获得的四肽YNKL的体外ACE活性抑制IC50为21 μmol/L，为YKYY活性的3倍，但是SHR口服相同剂量的YNKL 2 h后，其收缩压降低效果与YKYY的降压效果没有显著差异[20]。这可能是因为体内消化环境使这2个四肽发生进一步的水解，造成活性的改变，也可能是由于YKYY在体内除了通过RAS系统调节血压之外，还通过其他途径调节血压，如：氧化应激和基因转录调控等。另外，YKYY和YNKL是已报道的抗高血压肽中体内降压效果最好的2个小肽，具有较好的商业化前景。
4海洋抗高血压生物活性肽的构效关系
目前，有关活性肽的ACE抑制活性与其结构之间的关系已经进行了一些研究，但是单纯的海洋生物源生物活性肽的ACE抑制活性与其结构之间的确切关系尚未见系统研究。基于已有的研究结果，笔者发现海洋生物源生物活性肽的ACE抑制活性与其分子量、氨基酸的种类和排列顺序以及肽的构象有密切的关系。 4.1分子质量对抗高血压肽活性的影响分子量是生物活性肽活性功能体现的最重要的影响因子之一。从海洋生物蛋白中制备获得ACE抑制活性肽的分子量范圍为2～21个氨基酸组成（表1）。在统计的72个明确了ACE活性抑制IC50的2～3肽的ACE活性抑制IC50中位数为51 μmol/L，而58个明确了ACE活性抑制IC50的4～21肽的ACE活性抑制IC50中位数为38.25 μmol/L。这并不能说明小肽的分子量的大小与其ACE抑制活性之间存在必然的相关性，例如Lee等利用胃蛋白酶水解金枪鱼骨架蛋白制备获得21肽GDLGKTTTVSNWSPPKY KDTP的ACE活性抑制IC50为11.28 μmol/L[10]；Wu 等利用来源于Bacillus sp. SM98011的蛋白酶SM98011水解鲨鱼肌肉蛋白获得二肽MF，其ACE活性抑制IC50为0.92 μmol/L[11]；而Yokoyama等利用嗜热菌蛋白酶水解干燥的鲣鱼肌肉蛋白制备获得5肽LKPNM，其ACE活性抑制IC50为17 μmol/L[27]。后来，Fujita等发现LKPNM被ACE水解后的LKP的ACE抑制活性是LKPNM的8倍[58]。这说明生物活性肽活性可能与肽的氨基酸组成有关。
4.2氨基酸组成和一级结构对抗高血压肽活性的影响研究表明，生物活性肽的ACE抑制活性与其氨基酸的组成具有很高的相关性，这可能是由这些组成氨基酸的结构特征决定的。关于ACE抑制活性肽的QSAR研究表明，组成小肽的氨基酸的分子质量、拓扑结构、疏水性、电荷和静电特征等是影响其活性的关键变量[59]。具有较高ACE抑制活性的2～3肽的C-末端通常是Tyr、Phe、Trp或Pro，其N-末端通常为Val、Lue和Ile等脂肪族支链氨基酸[60-61]。Ono等和Enari等利用嗜热菌蛋白酶和胃蛋白酶水解大马哈鱼肌肉蛋白制备获得ACE抑制活性较高的2肽LW[5]、IW[5]、MW[5]、VW[5]、AW[22]、IW[23]和LW[23]等的C-末端均为Trp残基，相对活性较高的小肽N-末端都含有Val、Lue和Ile残基，且对活性的影响Val>Ile>Lue。这可能与芳香族氨基酸的疏水性以及Trp的正电荷特性相关[59]。Toshiaki等从凤尾鱼、沙丁鱼和鲣鱼酱中分离获得ACE抑制活性较高的2～3肽的C-末端均为Pro残基，如AP、KP、和RP[25]。此外，ACE抑制活性肽中Pro残基的存在，尤其是C-末端的Pro，具有耐受消化酶降解的特点，能够提高其体内的生物利用度，更有机会以完整形式作用于其靶标。
即使小肽的氨基酸组成相同，氨基酸排列顺序的不同也对其ACE抑制活性和抑制方式具有重要的影响。Ono等利用嗜热菌蛋白酶水解大马哈鱼肌肉蛋白制备获得2个二肽MW和WM，其中MW的ACE抑制活性是WM的10倍，且MW的抑制方式是非竞争性抑制而WM为竞争性抑制[5]；同样的另外2个二肽VW和WV，前者的ACE抑制活性是后者200倍，且前者的作用方式为反抑制作用，后者为竞争性抑制[5]。Ono等同样利用嗜热菌蛋白酶水解马苏大马哈鱼肌肉蛋白获得2个二肽FL和LF，其中FL的ACE抑制活性是LF的28倍，且前者的抑制方式为非竞争性，后者为竞争性抑制[22]。同时，他们获得另外2对二肽LY和YL以及LW和WL，虽然它们之间的ACE抑制活性相差2倍左右，但其抑制方式一致，分别为竞争性抑制和非竞争性抑制。笔者发现，氨基酸组成相同但顺序不同的小肽之间ACE抑制活性差异越大，其抑制方式越可能不同，这可能与顺序差异导致小肽的拓扑结构的改变相关联，尤其是在较大分子量的小肽中表现更为显著[62]。
5海洋抗高血压肽的商业化状况
在日本，一些含有海水鱼蛋白水解物/肽为功能成分的特定保健用食品（Food for Specified Health Uses，FOSHU）已经获准商业化，这些产品均宣称适合轻度高血压人群消费，如Lapis SupportTM和Valtyron。两者都是以沙丁鱼的蛋白水解产物为主要功能成分，其中Lapis SupportTM是以饮料的形式售卖，而Valtyron却以33种产品形式售卖，包括饮料、果冻、汤料粉和膳食补充剂等[63]。另外一个被准允商业化的产品是利用嗜热菌蛋白酶水解鲣鱼形成的抗高血压肽速溶粉汤料，其主要功能成分为抗高血压活性肽LKPNM，它可以显著降低轻度高血压患者的收缩压。除了以饮料产品售卖外，在日本鲣鱼肽也以粉剂和片剂形式售卖，如Peptide ACE 3000。这些鲣鱼肽片剂在美国和加拿大均有销售，其商品名称分别为Vasotensin和Levenorm[63]。
6海洋抗高血压肽的应用前景与研究展望
虽然ACE活性抑制肽相对于常规的抗高血压药物存在剂量效应上的弱势，但是抗高血压药物通常具有一些副作用，如造成干咳、瘙痒等。然而，ACE活性抑制肽来源于天然的蛋白质，作用温和、安全没有副作用，可以每天食用。同时，一些ACE活性抑制肽还具有多重的生物学效应，如抗氧化和抗炎症等[64]，使之可能成为抗高血压药物日常替代品。海洋环境的生物多样性和特殊性造就了海洋生物蛋白质的组成和氨基酸序列与陆生生物的蛋白具有较大的差异性，蕴含着丰富的生物活性肽资源。利用海洋生物蛋白或废弃物料制备抗高血压肽具有较好的应用前景。
但是，目前抗高血压肽的生产工艺主要是通过体外蛋白酶水解或食品加工（主要是利用食品级微生物发酵处理）。由于通常采用的是复合酶消化水解蛋白和多种微生物进行发酵处理，所以生产的活性肽都是复杂的混合物。而且对完整大分子蛋白质的水解能力较差，水解程度较低，水解产物粘度较大，这些局限性导致了抗高血压肽的得率很低，不适合规模化生产。同时，利用RPHPLC等技术从复杂的生物活性肽混合物中分离出目的活性肽过程繁杂，且缺乏高通量的活性鉴定技术体系。因此，这种高成本、低重复性和低生物利用率的体外酶解消化生产生物活性肽的生产工艺迫切需要发展一种新的替代生产技术。同时，由于二肽和三肽具有耐受体内消化酶的作用、易被吸收和易向合成药物转化等特点，所以在海洋生物源抗高血压肽的筛选和鉴定研究中，人们更应该关注2～3个氨基酸组成抗高血肽的挖掘。 目前不同的研究中采用的ACE抑制活性分析試验方法体系存在差异，如紫外分光度法、可见光分光光度法、荧光分析法、毛细管电泳法和色谱法等，使得不同实验室间的结果很难进行直接的比较分析。因此，建立ACE抑制活性分析的标准方法体系十分重要，这样有助于建立一个科学的、可参考的海洋生物源抗高血压生物活性肽库，方便开展抗高血压肽的结构与效应关系的解析。通过构建的抗高血压肽的构效关系，利用生物信息学方法，建立抗高血压肽的靶向生产方式也十分重要。
此外，抗高血压肽活性的体现具有食品体系的依赖性。不同的食品体系对其稳定性和体内的生物利用率具有影响。因此，采用更准确的接近目标食物和生物体系的模拟体系来进行活性分析尤为重要。同时，突围现有的研究仍然停留在体外化学分析的局限，通过设计巧妙的动物体内试验和人类临床研究进一步评估其健康促进作用和潜在的风险也需要予以关注。
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