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摘要：目的 建立双黄连粉针剂的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱。方法 采用Acquity UPLCTM BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，柱温40 ℃。对13批双黄连粉针剂的特征色谱图进行聚类分析，同时采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》对其质量进行评价。结果 建立了13批双黄连粉针剂的UPLC指纹图谱共有模式，特征图谱有16个共有峰，以对照品为对照，指认了3个主要色谱峰，各色谱峰有较好的分离效果。各批次间一致性良好，工艺稳定。结论 本方法快速、高效，可用于全面控制双黄连粉针剂的质量。
关键词：双黄连粉针剂；指纹图谱；超高效液相色谱法；聚类分析
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0091-04
双黄连粉针剂由金银花、黄芩、连翘3味中药经提取精制成中药注射剂，临床上加入适当溶媒供静脉注射用，现已广泛用于治疗肺炎、扁桃体炎、上呼吸道感染、急性肾盂肾炎、急性胆囊炎、小儿肠炎、婴幼儿肺炎、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒Ⅲ型感染等多种疾病[1]。
中药指纹图谱对中药材和中药制剂的质量控制具有重要作用，也是中药质量标准一种重要的检测手段。中药指纹图谱技术能标示出中药材的特征图谱和共有峰图谱，从而辨别真伪，用于控制中药材的质量，评价制剂原料药材、半成品及成品质量的均一性和稳定性。超高液相色谱法（UPLC）相对于高效液相色谱法具有更好的分离效率、峰容量及灵敏度[2]，现有的对于双黄连粉针剂的质量控制方法是以黄芩苷、绿原酸和连翘苷为质量控制指标，而这种质量评价方法不够全面，因此，本试验建立双黄连粉针剂的UPLC指纹图谱，为高效控制和评价双黄连粉针剂的质量提供依据。
1 仪器与试药
美国Waters Acquity UPLCTM超高效液相色谱仪（包括在线真空脱气机、自动进样器、四元梯度泵、二极管阵列检测器和柱温箱），美国Micromass Q-TOF microTM四极杆-飞行时间质谱仪（电喷雾离子源-正、负离子扫描方法-Lockspray），MassLynx V4.1色谱工作站，KQ-5200E昆山舒美超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），JA-2003精密电子天平（上海市良平仪器厂）。
对照品黄芩苷（批号110715-201314，供含量测定用）、连翘苷（批号110821-201213，供含量测定用）、绿原酸（批号110753-201314，供含量测定用），购于中国食品药品检定研究院；双黄连粉针剂由哈药集团中药二厂生产，批号1409405、1409406、1409407、1409408、1409409、1409410、1409411、1409413、1409414、1409416、1409417、1409418、1409419。乙腈为色谱纯（美国Fisher公司），甲酸为色谱级（天津科密欧化学试剂有限公司），其他试剂均为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Acquity UPLCTM BEH C18柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm，Waters Corp，Milford USA）；流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水，梯度洗脱（0→3 min，5%→10%A；3→5 min，10%→12%A；5→9 min，12%→14%A；9→10 min， 14%→16%A；10→12 min，16%→19%A；12→14 min， 19%→20%A；14→16 min，20%→23%A；16→18 min， 23%→40%A；18→22 min，40%→100%A；22→23 min， 100%A）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：3 μL。
2.2 质谱条件
电喷雾电离源（ESI），采用正离子扫描检测；碰撞能：100 V；干燥气温度：350 ℃；干燥器流速：11 L/min；雾化器压力：276 kPa；毛细管电压：4 kV；扫描方式为全扫描，质量扫描范围：m/z 100～1500。
2.3 对照品溶液制备
分别精密称取黄芩苷、连翘苷、绿原酸对照品，加50%甲醇溶液分别制成每1 mL含黄芩苷0.1 mg、连翘苷60 μg、绿原酸40 μg的混合对照品溶液。
2.4 供试品溶液的制备
从每批次随机取本品5支的内容物，混匀，取本品50 mg，精密称定，置25 mL锥形瓶中，加50%甲醇溶液20 mL，密塞后超声处理（功率250 W，频率40 kHz） 20 min，定容于25 mL容量瓶中，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验 取双黄连粉针剂样品（批号1409405），按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，检测其特征指纹图谱，各共有色谱峰相对于参比峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%，表明所用仪器精密度良好[3]。
2.5.2 重复性试验 取双黄连粉针剂样品（批号1409405），按“2.4”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。各共有色谱峰相对于参比峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%，结果表明本方法重复性良好。
2.5.3 稳定性试验 取双黄连粉针剂供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，在0、2、4、6、8、12、24 h检测特征指纹图谱，记录色谱图。结果显示，各共有色谱峰相对于参比峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%，表明本品24 h内稳定性良好。 2.6 样品测定
取13个批次双黄连粉针剂，分别按“2.4”项下方法依次制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，依次进样3 μL检测，记录色谱图。13批样品叠加图见图1，对照品和供试品色谱图见图2。
2.7 指纹图谱分析与评价
2.7.1 共有峰的确定 通过对13批样品的指纹图谱进行分析，选择特征明显的16个色谱峰为共有峰。根据13批供试品溶液UPLC指纹图谱给出的参数，比较供试品图谱，有16个色谱峰是各批供试品所共有的，分别为1、2、4、6、7、8、9、13、14、15、19、21、22、24、27、28号色谱峰，并指认了其中3个色谱峰为特征峰，并对其进行定性，分别为绿原酸（4号峰）、黄芩苷（22号峰）、连翘苷（24号峰）。
2.7.2 参比峰的选择 在各批次双黄连粉针剂的色谱图中，绿原酸的色谱峰（4号峰）峰面积适中，分离度良好，且为所有批次样品所共有，故确定绿原酸的色谱峰为参照峰。
2.7.3 相似度评价 将13批双黄连粉针剂的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》软件，评价其相似度[4]，结果依次为0.911、0.944、0.965、0.934、0.946、0.955、0.978、0.946、0.975、0.971、0.965、0.939、0.906。13个批次双黄连粉针剂的相似度除1409405、1409419两批次略低，其余批次均较高，说明其工艺比较稳定。用该方法可对双黄连粉针剂进行质量控制。
2.7.4 聚类分析 将13批双黄连粉针剂进行UPLC指纹图谱分析所获得的16个共有峰，相对参比峰进行色谱峰面积标准化，共得到16×13阶原始数据矩阵，采用IBM SPSS Statistics 21.0软件对其进行系统聚类分析，采用组间联结的方法，度量标准采用欧式距离[5]，聚类分析树状图见图3。聚类分析将13批双黄连粉针剂分为2类，S1、S13为一类，S2～S12为一类，这与指纹图谱相似度分析结果基本一致。
3 讨论
本试验将UPLC技术应用于双黄连粉针剂的指纹图谱研究，检测时间仅需20 min，较HPLC分析[6]缩短了时间，同时大大提高了各色谱峰的分离度和灵敏度，减少了流动相的消耗[7]。
本研究通过建立13个批次双黄连粉针剂指纹图谱，对其中多个组分进行了研究，不限定域值，共有30个色谱峰。除11号峰后有一堆分离较差、峰形不对称的色谱峰，会影响11号峰的分离度，其余色谱峰的分离度较好。同时对3个特征色谱峰的归属进行了定性分析，供试品溶液的色谱图与对照图谱基本一致，各色谱峰分离良好，色谱峰数量、保留时间与对照图谱相同。
本研究较全面分析了双黄连粉针剂指纹图谱中所含的化学成分及主要药效物质基础，相似度评价采用国家药典委员会推荐使用的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》，该系统利用夹角余弦进行全谱图计算，多点校正，结果可信。通过对13个批次双黄连粉针剂的检测和分析，结果表明各批次间稳定性和一致性良好，为双黄连粉针剂的全面质量控制提供了依据。
参考文献：
[1] 张洁，马百平，赵阳，等.双黄连粉针剂指纹图谱中特征色谱峰的组成药味归属及定性[J].中成药，2005，27（12）：1365-1369.
[2] 金高娃，章飞芳，薛兴亚，等.超高效液相色谱在复杂体系中药分离分析中的应用[J].世界科学技术-中医药现代化，2006，8（3）：106-108.
[3] 罗洁，范旭航，崔思娇，等.知母的UPLC指纹图谱及聚类分析[J].中国现代应用药学，2013，30（1）：28-31.
[4] 谢培山.色谱指纹图谱分析是中草药质量控制的可行策略[J].中药新药与临床药理，2001，12（3）：141-151.
[5] 陈蓉，沈蓓，吴启南.基于主成分分析和聚类判别模式对不同产地芡实HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2012，34（5）：781-783.
[6] 李方，姜文红，刘丽娟，等.注射用双黄连（冻干）指纹图谱的建立及其在质量控制中的应用[J].中成药，2007，29（8）：1196-1198.
[7] 张翠英，董梁，陈士林，等.人参药材皂苷类成分UPLC特征图谱的质量评价方法[J].药学学报，2010，45（10）：1296-1300.
（收稿日期：2014-12-06；编辑：陈静）
关键词：双黄连粉针剂；指纹图谱；超高效液相色谱法；聚类分析
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0091-04
双黄连粉针剂由金银花、黄芩、连翘3味中药经提取精制成中药注射剂，临床上加入适当溶媒供静脉注射用，现已广泛用于治疗肺炎、扁桃体炎、上呼吸道感染、急性肾盂肾炎、急性胆囊炎、小儿肠炎、婴幼儿肺炎、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒Ⅲ型感染等多种疾病[1]。
中药指纹图谱对中药材和中药制剂的质量控制具有重要作用，也是中药质量标准一种重要的检测手段。中药指纹图谱技术能标示出中药材的特征图谱和共有峰图谱，从而辨别真伪，用于控制中药材的质量，评价制剂原料药材、半成品及成品质量的均一性和稳定性。超高液相色谱法（UPLC）相对于高效液相色谱法具有更好的分离效率、峰容量及灵敏度[2]，现有的对于双黄连粉针剂的质量控制方法是以黄芩苷、绿原酸和连翘苷为质量控制指标，而这种质量评价方法不够全面，因此，本试验建立双黄连粉针剂的UPLC指纹图谱，为高效控制和评价双黄连粉针剂的质量提供依据。
1 仪器与试药
美国Waters Acquity UPLCTM超高效液相色谱仪（包括在线真空脱气机、自动进样器、四元梯度泵、二极管阵列检测器和柱温箱），美国Micromass Q-TOF microTM四极杆-飞行时间质谱仪（电喷雾离子源-正、负离子扫描方法-Lockspray），MassLynx V4.1色谱工作站，KQ-5200E昆山舒美超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），JA-2003精密电子天平（上海市良平仪器厂）。
对照品黄芩苷（批号110715-201314，供含量测定用）、连翘苷（批号110821-201213，供含量测定用）、绿原酸（批号110753-201314，供含量测定用），购于中国食品药品检定研究院；双黄连粉针剂由哈药集团中药二厂生产，批号1409405、1409406、1409407、1409408、1409409、1409410、1409411、1409413、1409414、1409416、1409417、1409418、1409419。乙腈为色谱纯（美国Fisher公司），甲酸为色谱级（天津科密欧化学试剂有限公司），其他试剂均为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Acquity UPLCTM BEH C18柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm，Waters Corp，Milford USA）；流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水，梯度洗脱（0→3 min，5%→10%A；3→5 min，10%→12%A；5→9 min，12%→14%A；9→10 min， 14%→16%A；10→12 min，16%→19%A；12→14 min， 19%→20%A；14→16 min，20%→23%A；16→18 min， 23%→40%A；18→22 min，40%→100%A；22→23 min， 100%A）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：3 μL。
2.2 质谱条件
电喷雾电离源（ESI），采用正离子扫描检测；碰撞能：100 V；干燥气温度：350 ℃；干燥器流速：11 L/min；雾化器压力：276 kPa；毛细管电压：4 kV；扫描方式为全扫描，质量扫描范围：m/z 100～1500。
2.3 对照品溶液制备
分别精密称取黄芩苷、连翘苷、绿原酸对照品，加50%甲醇溶液分别制成每1 mL含黄芩苷0.1 mg、连翘苷60 μg、绿原酸40 μg的混合对照品溶液。
2.4 供试品溶液的制备
从每批次随机取本品5支的内容物，混匀，取本品50 mg，精密称定，置25 mL锥形瓶中，加50%甲醇溶液20 mL，密塞后超声处理（功率250 W，频率40 kHz） 20 min，定容于25 mL容量瓶中，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验 取双黄连粉针剂样品（批号1409405），按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，检测其特征指纹图谱，各共有色谱峰相对于参比峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%，表明所用仪器精密度良好[3]。
2.5.2 重复性试验 取双黄连粉针剂样品（批号1409405），按“2.4”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。各共有色谱峰相对于参比峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%，结果表明本方法重复性良好。
2.5.3 稳定性试验 取双黄连粉针剂供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，在0、2、4、6、8、12、24 h检测特征指纹图谱，记录色谱图。结果显示，各共有色谱峰相对于参比峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3.0%，表明本品24 h内稳定性良好。 2.6 样品测定
取13个批次双黄连粉针剂，分别按“2.4”项下方法依次制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，依次进样3 μL检测，记录色谱图。13批样品叠加图见图1，对照品和供试品色谱图见图2。
2.7 指纹图谱分析与评价
2.7.1 共有峰的确定 通过对13批样品的指纹图谱进行分析，选择特征明显的16个色谱峰为共有峰。根据13批供试品溶液UPLC指纹图谱给出的参数，比较供试品图谱，有16个色谱峰是各批供试品所共有的，分别为1、2、4、6、7、8、9、13、14、15、19、21、22、24、27、28号色谱峰，并指认了其中3个色谱峰为特征峰，并对其进行定性，分别为绿原酸（4号峰）、黄芩苷（22号峰）、连翘苷（24号峰）。
2.7.2 参比峰的选择 在各批次双黄连粉针剂的色谱图中，绿原酸的色谱峰（4号峰）峰面积适中，分离度良好，且为所有批次样品所共有，故确定绿原酸的色谱峰为参照峰。
2.7.3 相似度评价 将13批双黄连粉针剂的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》软件，评价其相似度[4]，结果依次为0.911、0.944、0.965、0.934、0.946、0.955、0.978、0.946、0.975、0.971、0.965、0.939、0.906。13个批次双黄连粉针剂的相似度除1409405、1409419两批次略低，其余批次均较高，说明其工艺比较稳定。用该方法可对双黄连粉针剂进行质量控制。
2.7.4 聚类分析 将13批双黄连粉针剂进行UPLC指纹图谱分析所获得的16个共有峰，相对参比峰进行色谱峰面积标准化，共得到16×13阶原始数据矩阵，采用IBM SPSS Statistics 21.0软件对其进行系统聚类分析，采用组间联结的方法，度量标准采用欧式距离[5]，聚类分析树状图见图3。聚类分析将13批双黄连粉针剂分为2类，S1、S13为一类，S2～S12为一类，这与指纹图谱相似度分析结果基本一致。
3 讨论
本试验将UPLC技术应用于双黄连粉针剂的指纹图谱研究，检测时间仅需20 min，较HPLC分析[6]缩短了时间，同时大大提高了各色谱峰的分离度和灵敏度，减少了流动相的消耗[7]。
本研究通过建立13个批次双黄连粉针剂指纹图谱，对其中多个组分进行了研究，不限定域值，共有30个色谱峰。除11号峰后有一堆分离较差、峰形不对称的色谱峰，会影响11号峰的分离度，其余色谱峰的分离度较好。同时对3个特征色谱峰的归属进行了定性分析，供试品溶液的色谱图与对照图谱基本一致，各色谱峰分离良好，色谱峰数量、保留时间与对照图谱相同。
本研究较全面分析了双黄连粉针剂指纹图谱中所含的化学成分及主要药效物质基础，相似度评价采用国家药典委员会推荐使用的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》，该系统利用夹角余弦进行全谱图计算，多点校正，结果可信。通过对13个批次双黄连粉针剂的检测和分析，结果表明各批次间稳定性和一致性良好，为双黄连粉针剂的全面质量控制提供了依据。
参考文献：
[1] 张洁，马百平，赵阳，等.双黄连粉针剂指纹图谱中特征色谱峰的组成药味归属及定性[J].中成药，2005，27（12）：1365-1369.
[2] 金高娃，章飞芳，薛兴亚，等.超高效液相色谱在复杂体系中药分离分析中的应用[J].世界科学技术-中医药现代化，2006，8（3）：106-108.
[3] 罗洁，范旭航，崔思娇，等.知母的UPLC指纹图谱及聚类分析[J].中国现代应用药学，2013，30（1）：28-31.
[4] 谢培山.色谱指纹图谱分析是中草药质量控制的可行策略[J].中药新药与临床药理，2001，12（3）：141-151.
[5] 陈蓉，沈蓓，吴启南.基于主成分分析和聚类判别模式对不同产地芡实HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2012，34（5）：781-783.
[6] 李方，姜文红，刘丽娟，等.注射用双黄连（冻干）指纹图谱的建立及其在质量控制中的应用[J].中成药，2007，29（8）：1196-1198.
[7] 张翠英，董梁，陈士林，等.人参药材皂苷类成分UPLC特征图谱的质量评价方法[J].药学学报，2010，45（10）：1296-1300.
（收稿日期：2014-12-06；编辑：陈静）