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【摘要】 目的：观察阿托伐他汀对实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE）Wistar大鼠的发病情况、组织病理变化及脑组织内T细胞免疫球蛋白和黏液域蛋白-3（TIM-3）、T细胞免疫球蛋白和黏液域蛋白-1（TIM-1）表达水平的影响。方法：将30只雌性Wistar大鼠随机分为佐剂组、EAE组、阿托伐他汀组，以豚鼠脊髓匀浆（GPSCH）诱发制备大鼠EAE模型，并于给予GPSCH当日开始1次/d灌服0.1% PBS溶液1.5 ml/只（佐剂组和EAE组）和含阿托伐他汀的0.1% PBS溶液，1次/d，剂量为8 mg/（kg·d），连续13 d，观察EAE症状并评分，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测Tim-1 mRNA、Tim-3 mRNA在脑组织中的表达。结果：阿托伐他汀组发病率降低、临床症状减轻，体重下降减少（P<0.05）；与佐剂组比较，EAE组TIM-3 mRNA明显上升（P<0.05），阿托伐他汀组TIM-3 mRNA较EAE组明显下降（P<0.05）；与佐剂组比较，EAE组TIM-1 mRNA下降（P<0.05），阿托伐他汀组TIM-1 mRNA较EAE组上升（P<0.05）。结论：EAE大鼠TIM-3上升，TIM-1下降，提示其在EAE发病机制中发挥作用，通过下调TIM-3、上调TIM-1的表达，可能是阿托伐他汀对EAE保护作用机制之一。
【关键词】 实验性自身免疫性脑脊髓炎； 多发性硬化； TIM-3； TIM-1； 阿托伐他汀
实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE）是以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特征的疾病，是研究MS的理想动物模型[1]。T细胞免疫球蛋白和黏液域蛋白（TIM）家族是一类具有免疫调节作用的蛋白，可以作为Th细胞的分化标志[2]。TIM-3是TIM家族中的一员，Monney等[3]研究发现，在体内运用TIM-3特异性抗体使EAE小鼠疾病死亡率增加，中枢神经系统炎症病灶增多，增加和激活CD11b+细胞。TIM-1最先被发现与变应性哮喘的发生有关[4]。TIM-1选择性表达于Th2细胞上，在Th1细胞及Th17细胞上没有表达[5]。目前研究提示，在人体中，TIM-1不仅与过敏性疾病和哮喘有关，在自身免疫性疾病中也起着调节作用，如在类风湿关节炎的产生与TIM-1的外显子4相关，C反应蛋白与类风湿因子的水平与TIM-1基因的启动子多态性相关[6]。在MS缓解期患者脑脊液单核细胞上可检测到TIM-1 mRNA的表达，提示TIM-1对MS的恢复具有有益作用，其机制可能与免疫耐受有关[7]。
目前各种能够缓解EAE病情的免疫调节药物在MS的治疗作用仍在试验阶段，且存在相关的副作用及潜在的毒性作用[8]。最近发现，他汀类药物除了其调脂作用外，亦存在免疫调节作用使之用于治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病，如MS的研究越来越多[9]。他汀类药物运用于MS以及类风湿关节炎等得临床试验也已经得到有前景的结果[10]。他汀类药物的免疫调节作用包括有保护血脑屏障的完整性[11]，抑制中枢神经系统炎症细胞浸润[11]，促进Th1细胞反应向Th2细胞反应偏移等[9]。最近发现除外其免疫调节作用外，他汀类药物对EAE还具有神经保护和促进神经再生的作用[12]。
本实验从免疫诱导第1天开始予以阿托伐他汀药物治疗，根据国外文献报道，选择8 mg/（kg·d）作用治疗剂量，观察阿托伐他汀对EAE的治疗作用。并通过检测TIM-3及TIM-1 mRNA的表达情况检测阿托伐他汀是否通过影响其表达对EAE起治疗作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠30只，6～8周龄，体重（200±20）g，雌性；豚鼠10只，300～400 g，雌雄不限。购于湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场。在中南大学湘雅二医院动物实验中心分笼饲养，每笼5只。喂食本医院动物实验中心配置的大鼠饲料，饮自来水，保持室温（18±2）℃，相对湿度（50±10）％，人工光照时间12 h/d，自动抽风，每日上午更换食、水和垫料1次，饲养观察3 d，能正常进食和饮水者纳入实验用鼠。
1.2 主要试剂 阿托伐他汀购自大连辉瑞制药有限公司，卡介苗（BCG）冻干粉购自北京生物制品研究所，医用羊毛脂购自重庆化学试剂厂，罗可沙尔坚牢蓝购自Sigma公司，RT-PCR试剂盒由Fermentas公司生产，EDTA、Tris购自Sigma公司，引物由上海生物工程技术有限公司生产。
1.3 抗原制备 完全福氏佐剂（CFA）的配制：取医用的石蜡油40 ml，医用羊毛脂10 g，于三角瓶内充分混合，高温灭菌30 min，制成不完全福氏佐剂。将失活的卡介苗冻干粉60 mg用少量生理盐水溶解加入不完全福氏佐剂中充分混合均匀，制成含卡介苗为6 mg/ml的完全福氏佐剂，置于4 ℃冰箱保存。豚鼠脊髓匀浆（guinea pig spinal cord homogenate， GPSCH）提取和免疫抗原制作：用10％水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉豚鼠处死后，剥出脊髓，去掉马尾与脊膜并称重，加入少量无菌冰生理盐水，用手动匀浆器将其制成50％（质量浓度）的豚鼠脊髓匀浆。取等体积的GPSCH与CFA混匀制成稳定的油包水型乳剂，置于4 ℃的冰箱保存并于12 h内用于诱发EAE。
1.4 实验动物分组及干预处理 将30只雌性Wistar大鼠随机分为三组：佐剂组（CFA）（n=10），用生理盐水代替免疫抗原，常规饲养，即日开始灌服0.1% PBS溶液，每次灌服液体量1.5 ml/只，1次/d；EAE组（n=10），无菌操作下，在Wistar大鼠双后肢足垫皮下注射GPSCH-CFA乳剂（0.2 ml/100 g），EAE模型建立后，常规饲养，即日开始灌服0.1% PBS溶液，每次灌服液体量1.5 ml/只，1/d次。阿托伐他汀组（n=10），EAE模型建立后常规饲养，即日开始灌服含阿托伐他汀的0.1% PBS溶液，1次/d，剂量为8 mg/（kg·d）。 1.5 动物行为观察和神经功能障碍评分 将免疫抗原注射日定为第0天，每日称体重观察病情并进行神经功能障碍评分。从出现临床症状开始至实验终止每天按照Benson评分标准进行评分（如下），2次/d。1级：尾部无力或跋踞步态伴尾部有力；2级：蹒跚步态伴尾部无力（共济失调）；2.5级：共济失调伴部分单肢麻痹；3级：单肢完全麻痹；3.5级：单肢完全麻痹伴另一肢体部分麻痹；4级：双肢完全麻痹；4.5级；四肢麻痹；5级：死亡。
1.6 动物处死时间和标本处理 于大鼠免疫后第13天（相当于EAE组发病高峰期）终止实验，处死所有大鼠，无菌条件下迅速取出完整脑，留左脑后放入RNase-free的冻存管于液氮环境下保存，以作为提取RNA用。右脑标本放入4%多聚甲醛固定，进行HE染色和LFB染色。
1.7 RT-PCR法检测Tim-3 mRNA、Tim-1 mRNA表达 取保存液氮中的脑组织采取Trizol法提取各样本总RNA，紫外分光光度计测定浓度并定量后逆转录，逆转录产物进行PCR反应。根据GenBank中目的基因所对应的cDNA表达序列和提供的相关资料，利用软件Primer Premier 5.0设计上下游引物：TIM-3：上游引物：5′-CAATTCCCTGGCCCAATGAATGA-3′，下游引物：5′-ACTTCCCTCAGTGGTTAGGGTTCT-3′ Tm 60 ℃，产物长度为150 bp。TIM-1：上游引物5′-TGGTTGTCACCAGGTACATCA
TTATA-3′，下游引物：5′-TGCGTTCTGCAAAGCTCTACTC-3′ Tm 56 ℃，产物长度为170 bp。GAPDH：上游引物：5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3′，下游引物：5′-GTCTCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′ Tm 58 ℃，产物长度为450 bp。PCR反应条件见表1。
通过PCR最后确定TIM-3、TIM-1退火温度（Tm）分别为60 ℃、56 ℃，最后按照此条件进行所有样品的PCR扩展。产物于1%琼脂凝胶电泳；凝胶成像系统下观察。
1.8 数据分析 将图片采集，并用Quality one软件对图像进行灰度分析。
1.9 统计学处理 所有统计分析均用SPSS 17.0统计软件包完成，计量资料以（x±s）表示，多组计量资料均数比较用单因素完全随机方差分析（ANOVA），并做多组间两两均数比较（LSD-t检验法）。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验大鼠的发病率、体重及神经功能评分变化 佐剂组无大鼠发病。EAE组共有8只大鼠发病，发病率为80%，有1只大鼠死亡。阿托伐他汀组共有3只大鼠发病，发病率为30%。佐剂组大鼠体重逐步增加。EAE组各亚组大鼠的体重损失随病情加重而增加，在发病高峰时体重损失达到最高值。阿托伐他汀组大鼠体重损失较EAE组减少，比较差异有统计学意义（P<0.05）。佐剂组神经功能评分0。EAE组神经功能评分高于阿托伐他汀组（P<0.05）。见表2。
2.2 实验大鼠脑组织的病理学变化 佐剂组大鼠CNS HE染色结构清晰，无炎性细胞浸润（图3）。EAE组大鼠脑实质内可见血管“袖套”样改变，亦可见胶质细胞及一定数量的巨噬细胞（图4）。阿托伐他汀组大鼠脑组织炎性细胞浸润的程度较EAE组减少（图5）。LFB染色EAE组可见大片或融合的脱髓鞘灶，甚至轴索染色亦缺失，呈空泡样改变（图2）。阿托伐他汀组未见明显髓鞘脱失。
图5 阿托伐他汀组大鼠侧脑室周围组织未见炎性细胞浸润×400
2.3 RT-PCR结果 与佐剂组比较，EAE组TIM-3 mRNA上升（P<0.05），阿托伐他汀组TIM-3 mRNA较EAE组下降（P<0.05）。与佐剂组比较，EAE组TIM-1 mRNA下降（P<0.05），阿托伐他汀组TIM-1 mRNA较EAE组上升（P<0.05）。见表3。
3 讨论
以往EAE被认为是针对自身髓鞘的Th1型反应为主的自身免疫性疾病。近年来越来越多的证据提示，Th17细胞亦参与该疾病的病理过程。最初认为，CD4+效应T细胞分为Th1和Th2细胞两类。Th1/Th2平衡在EAE的发病机制中起着重要的作用。大多数学者认为，Th1/Th2平衡的偏移导致Th1细胞增多是造成MS发病的关键。TIM家族是一类具有免疫调节作用的蛋白，因为其在T细胞上表达情况的不同可以作为Th细胞的分化标志。TIM-3被发现特异性的表达于Th1细胞上，而在Th2细胞上无表达。TIM-1选择性表达与Th2细胞上，在Th1细胞及Th17细胞上没有表达。在MS缓解期患者脑脊液单核细胞上可检测到TIM-1mRNA的表达，提示TIM-1对MS的恢复具有有益作用，其机制可能与免疫耐受有关。综上所述，TIM-3可作为Th1细胞的分化标志，而TIM-1可作为Th2细胞的分化标志。本实验通过检测上述两个指标间接反应EAE大鼠中Th1细胞和Th2细胞的变化。在EAE大鼠中TIM-3 mRNA上升，TIM-1 mRNA下降，符合EAE发病过程中Th1型反应增多，同时Th2型反应有所下降，与文献报道结果一致。
目前大量研究发现，他汀类药物在体内抑制胆固醇生物合成同时，还具有免疫调节、抗炎及神经保护作用，对某些神经系统自身免疫性疾病如MS，EAE等有治疗作用。本实验中笔者使用阿托伐他汀干预EAE，结果发现，干预后的EAE大鼠发病率、神经功能损伤评分、体重变化等较佐剂组和EAE组大鼠明显减轻或延迟，病理方面炎性细胞浸润及脱髓鞘病变亦较EAE组明显减少。以上结果均证实阿托伐他汀对EAE大鼠的治疗作用。HE染色显示炎性细胞明显减少，推测其与抑制抑制T淋巴细胞向中枢神经系统迁移，保护BBB完整性，从而减少CNS系统炎性细胞浸润有关。LFB染色结果脱髓鞘病变少见，证实了阿托伐他汀的神经保护作用，推测其机制可能与抑制促炎性细胞因子诱导的细胞毒素释放，增强少突胶质干细胞的存活和分化，抑制反应性神经胶质增生，形成有利于髓鞘再生的环境。本实验还通过测定TIM-3及TIM-1mRNA发现，与EAE比较阿托伐他汀干预后TIM-3表达下降，TIM-1表达上升，提示其能通过减少Th1型反应减少EAE中枢神经系统炎症反应，并使之向Th2型反应转化，从而使EAE病情缓解，对EAE产生治疗作用。 综上所述，阿托伐他汀可能是一种有前景的多发性硬化治疗药物。
参考文献
[1] Sercarz E E. Driver clones and determinant spreading[J]. J Autoimmun，2000，14（4）：275-277.
[2] Kuchroo， V K， Umetsu D T， DeKruyff， R H， et al. The TIM gene family： emerging roles in immunity and disease[J]. Nat Rev Immunol，2003，3（6）：454-462.
[3] Monney L， Sabatos C A， Gaglia J L， et al. Th1-specific cell surface protein Tim-3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease[J]. Nature，2002，415（6871）：536-541.
[4] Sizing I D， Bailly V， McCoon P， et al. Epitope-dependent effect of anti-murine TIM-1 monoclonal antibodies on T cell activity and lung immune responses[J]. J Immunol，2007，178（4）：2249-2261.
[5] Umetsu S E， Lee W L， Mclntire J J， et al. TIM-1 induces T cell activation and inhibits the development of peripheral tolerance[J]. Nat Immunol，2005，6（5）：447-454.
[6] Chae S C， Park Y R， Song J H， et al. The polymorphisms of Tim-1 promoter region are associated with rheumatoid arthritis in a Korean population[J]. Immunogenetics，2005，56（10）：696-701.
[7] Khademi M， Illés Z， Gielen A W， et al. T Cell Ig- and mucin-domain-containing molecule-3（TIM-3） and TIM-1 molecules are differentially expressed on human Th1 and Th2 cells and in cerebrospinal fluid-derived mononuclear cells in multiple sclerosis[J]. J Immunol，2004，172（11）：7169-7176.
[8] Abbas， N， Zou L P， Pelidou， S H， et al. Protective effect of Rolipram in experimental autoimmune neuritis： protection is associated with down-regulation of IFN- gamma and inflammatory chemokines as well as up-regulation of IL-4 in peripheral nervous system[J]. Autoimmunity，2000，32（2）：93-99.
[9] Paintlia A S， Paintlia M K， Singh A K， et al. Inhibition of rho family functions by lovastatin promotes myelin repair in ameliorating experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Mol. Pharmacol，2008，73（5）：1381-1393.
[10] Vollmer T， Key L， Durkalski V， et al. Oral simvastatin treatment in relapsing-remit tings multiple sclerosis[J]. Lancet，2004，363（9421）：1607-1608.
[11] Stanislaus R， Singh A K， Singh I. 2001. Lovastatin treatment decreases mononuclear cell infiltration into the CNS of Lewis rats with experimental allergic encephalomyelitis[J]. J Neurosci Res，2001，66（2）：155-162.
[12] Paintlia A S， Paintlia M K， Kha M， et al. HMG-CoA reductase inhibitor augments survival and differentiation of oligodendrocyte progenitors in animal model of multiple sclerosis[J]. Faseb J，2005，19（11）：1407-1421.
（收稿日期：2012-11-14） （本文编辑：王宇）
【关键词】 实验性自身免疫性脑脊髓炎； 多发性硬化； TIM-3； TIM-1； 阿托伐他汀
实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE）是以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特征的疾病，是研究MS的理想动物模型[1]。T细胞免疫球蛋白和黏液域蛋白（TIM）家族是一类具有免疫调节作用的蛋白，可以作为Th细胞的分化标志[2]。TIM-3是TIM家族中的一员，Monney等[3]研究发现，在体内运用TIM-3特异性抗体使EAE小鼠疾病死亡率增加，中枢神经系统炎症病灶增多，增加和激活CD11b+细胞。TIM-1最先被发现与变应性哮喘的发生有关[4]。TIM-1选择性表达于Th2细胞上，在Th1细胞及Th17细胞上没有表达[5]。目前研究提示，在人体中，TIM-1不仅与过敏性疾病和哮喘有关，在自身免疫性疾病中也起着调节作用，如在类风湿关节炎的产生与TIM-1的外显子4相关，C反应蛋白与类风湿因子的水平与TIM-1基因的启动子多态性相关[6]。在MS缓解期患者脑脊液单核细胞上可检测到TIM-1 mRNA的表达，提示TIM-1对MS的恢复具有有益作用，其机制可能与免疫耐受有关[7]。
目前各种能够缓解EAE病情的免疫调节药物在MS的治疗作用仍在试验阶段，且存在相关的副作用及潜在的毒性作用[8]。最近发现，他汀类药物除了其调脂作用外，亦存在免疫调节作用使之用于治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病，如MS的研究越来越多[9]。他汀类药物运用于MS以及类风湿关节炎等得临床试验也已经得到有前景的结果[10]。他汀类药物的免疫调节作用包括有保护血脑屏障的完整性[11]，抑制中枢神经系统炎症细胞浸润[11]，促进Th1细胞反应向Th2细胞反应偏移等[9]。最近发现除外其免疫调节作用外，他汀类药物对EAE还具有神经保护和促进神经再生的作用[12]。
本实验从免疫诱导第1天开始予以阿托伐他汀药物治疗，根据国外文献报道，选择8 mg/（kg·d）作用治疗剂量，观察阿托伐他汀对EAE的治疗作用。并通过检测TIM-3及TIM-1 mRNA的表达情况检测阿托伐他汀是否通过影响其表达对EAE起治疗作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠30只，6～8周龄，体重（200±20）g，雌性；豚鼠10只，300～400 g，雌雄不限。购于湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场。在中南大学湘雅二医院动物实验中心分笼饲养，每笼5只。喂食本医院动物实验中心配置的大鼠饲料，饮自来水，保持室温（18±2）℃，相对湿度（50±10）％，人工光照时间12 h/d，自动抽风，每日上午更换食、水和垫料1次，饲养观察3 d，能正常进食和饮水者纳入实验用鼠。
1.2 主要试剂 阿托伐他汀购自大连辉瑞制药有限公司，卡介苗（BCG）冻干粉购自北京生物制品研究所，医用羊毛脂购自重庆化学试剂厂，罗可沙尔坚牢蓝购自Sigma公司，RT-PCR试剂盒由Fermentas公司生产，EDTA、Tris购自Sigma公司，引物由上海生物工程技术有限公司生产。
1.3 抗原制备 完全福氏佐剂（CFA）的配制：取医用的石蜡油40 ml，医用羊毛脂10 g，于三角瓶内充分混合，高温灭菌30 min，制成不完全福氏佐剂。将失活的卡介苗冻干粉60 mg用少量生理盐水溶解加入不完全福氏佐剂中充分混合均匀，制成含卡介苗为6 mg/ml的完全福氏佐剂，置于4 ℃冰箱保存。豚鼠脊髓匀浆（guinea pig spinal cord homogenate， GPSCH）提取和免疫抗原制作：用10％水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉豚鼠处死后，剥出脊髓，去掉马尾与脊膜并称重，加入少量无菌冰生理盐水，用手动匀浆器将其制成50％（质量浓度）的豚鼠脊髓匀浆。取等体积的GPSCH与CFA混匀制成稳定的油包水型乳剂，置于4 ℃的冰箱保存并于12 h内用于诱发EAE。
1.4 实验动物分组及干预处理 将30只雌性Wistar大鼠随机分为三组：佐剂组（CFA）（n=10），用生理盐水代替免疫抗原，常规饲养，即日开始灌服0.1% PBS溶液，每次灌服液体量1.5 ml/只，1次/d；EAE组（n=10），无菌操作下，在Wistar大鼠双后肢足垫皮下注射GPSCH-CFA乳剂（0.2 ml/100 g），EAE模型建立后，常规饲养，即日开始灌服0.1% PBS溶液，每次灌服液体量1.5 ml/只，1/d次。阿托伐他汀组（n=10），EAE模型建立后常规饲养，即日开始灌服含阿托伐他汀的0.1% PBS溶液，1次/d，剂量为8 mg/（kg·d）。 1.5 动物行为观察和神经功能障碍评分 将免疫抗原注射日定为第0天，每日称体重观察病情并进行神经功能障碍评分。从出现临床症状开始至实验终止每天按照Benson评分标准进行评分（如下），2次/d。1级：尾部无力或跋踞步态伴尾部有力；2级：蹒跚步态伴尾部无力（共济失调）；2.5级：共济失调伴部分单肢麻痹；3级：单肢完全麻痹；3.5级：单肢完全麻痹伴另一肢体部分麻痹；4级：双肢完全麻痹；4.5级；四肢麻痹；5级：死亡。
1.6 动物处死时间和标本处理 于大鼠免疫后第13天（相当于EAE组发病高峰期）终止实验，处死所有大鼠，无菌条件下迅速取出完整脑，留左脑后放入RNase-free的冻存管于液氮环境下保存，以作为提取RNA用。右脑标本放入4%多聚甲醛固定，进行HE染色和LFB染色。
1.7 RT-PCR法检测Tim-3 mRNA、Tim-1 mRNA表达 取保存液氮中的脑组织采取Trizol法提取各样本总RNA，紫外分光光度计测定浓度并定量后逆转录，逆转录产物进行PCR反应。根据GenBank中目的基因所对应的cDNA表达序列和提供的相关资料，利用软件Primer Premier 5.0设计上下游引物：TIM-3：上游引物：5′-CAATTCCCTGGCCCAATGAATGA-3′，下游引物：5′-ACTTCCCTCAGTGGTTAGGGTTCT-3′ Tm 60 ℃，产物长度为150 bp。TIM-1：上游引物5′-TGGTTGTCACCAGGTACATCA
TTATA-3′，下游引物：5′-TGCGTTCTGCAAAGCTCTACTC-3′ Tm 56 ℃，产物长度为170 bp。GAPDH：上游引物：5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3′，下游引物：5′-GTCTCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′ Tm 58 ℃，产物长度为450 bp。PCR反应条件见表1。
通过PCR最后确定TIM-3、TIM-1退火温度（Tm）分别为60 ℃、56 ℃，最后按照此条件进行所有样品的PCR扩展。产物于1%琼脂凝胶电泳；凝胶成像系统下观察。
1.8 数据分析 将图片采集，并用Quality one软件对图像进行灰度分析。
1.9 统计学处理 所有统计分析均用SPSS 17.0统计软件包完成，计量资料以（x±s）表示，多组计量资料均数比较用单因素完全随机方差分析（ANOVA），并做多组间两两均数比较（LSD-t检验法）。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验大鼠的发病率、体重及神经功能评分变化 佐剂组无大鼠发病。EAE组共有8只大鼠发病，发病率为80%，有1只大鼠死亡。阿托伐他汀组共有3只大鼠发病，发病率为30%。佐剂组大鼠体重逐步增加。EAE组各亚组大鼠的体重损失随病情加重而增加，在发病高峰时体重损失达到最高值。阿托伐他汀组大鼠体重损失较EAE组减少，比较差异有统计学意义（P<0.05）。佐剂组神经功能评分0。EAE组神经功能评分高于阿托伐他汀组（P<0.05）。见表2。
2.2 实验大鼠脑组织的病理学变化 佐剂组大鼠CNS HE染色结构清晰，无炎性细胞浸润（图3）。EAE组大鼠脑实质内可见血管“袖套”样改变，亦可见胶质细胞及一定数量的巨噬细胞（图4）。阿托伐他汀组大鼠脑组织炎性细胞浸润的程度较EAE组减少（图5）。LFB染色EAE组可见大片或融合的脱髓鞘灶，甚至轴索染色亦缺失，呈空泡样改变（图2）。阿托伐他汀组未见明显髓鞘脱失。
图5 阿托伐他汀组大鼠侧脑室周围组织未见炎性细胞浸润×400
2.3 RT-PCR结果 与佐剂组比较，EAE组TIM-3 mRNA上升（P<0.05），阿托伐他汀组TIM-3 mRNA较EAE组下降（P<0.05）。与佐剂组比较，EAE组TIM-1 mRNA下降（P<0.05），阿托伐他汀组TIM-1 mRNA较EAE组上升（P<0.05）。见表3。
3 讨论
以往EAE被认为是针对自身髓鞘的Th1型反应为主的自身免疫性疾病。近年来越来越多的证据提示，Th17细胞亦参与该疾病的病理过程。最初认为，CD4+效应T细胞分为Th1和Th2细胞两类。Th1/Th2平衡在EAE的发病机制中起着重要的作用。大多数学者认为，Th1/Th2平衡的偏移导致Th1细胞增多是造成MS发病的关键。TIM家族是一类具有免疫调节作用的蛋白，因为其在T细胞上表达情况的不同可以作为Th细胞的分化标志。TIM-3被发现特异性的表达于Th1细胞上，而在Th2细胞上无表达。TIM-1选择性表达与Th2细胞上，在Th1细胞及Th17细胞上没有表达。在MS缓解期患者脑脊液单核细胞上可检测到TIM-1mRNA的表达，提示TIM-1对MS的恢复具有有益作用，其机制可能与免疫耐受有关。综上所述，TIM-3可作为Th1细胞的分化标志，而TIM-1可作为Th2细胞的分化标志。本实验通过检测上述两个指标间接反应EAE大鼠中Th1细胞和Th2细胞的变化。在EAE大鼠中TIM-3 mRNA上升，TIM-1 mRNA下降，符合EAE发病过程中Th1型反应增多，同时Th2型反应有所下降，与文献报道结果一致。
目前大量研究发现，他汀类药物在体内抑制胆固醇生物合成同时，还具有免疫调节、抗炎及神经保护作用，对某些神经系统自身免疫性疾病如MS，EAE等有治疗作用。本实验中笔者使用阿托伐他汀干预EAE，结果发现，干预后的EAE大鼠发病率、神经功能损伤评分、体重变化等较佐剂组和EAE组大鼠明显减轻或延迟，病理方面炎性细胞浸润及脱髓鞘病变亦较EAE组明显减少。以上结果均证实阿托伐他汀对EAE大鼠的治疗作用。HE染色显示炎性细胞明显减少，推测其与抑制抑制T淋巴细胞向中枢神经系统迁移，保护BBB完整性，从而减少CNS系统炎性细胞浸润有关。LFB染色结果脱髓鞘病变少见，证实了阿托伐他汀的神经保护作用，推测其机制可能与抑制促炎性细胞因子诱导的细胞毒素释放，增强少突胶质干细胞的存活和分化，抑制反应性神经胶质增生，形成有利于髓鞘再生的环境。本实验还通过测定TIM-3及TIM-1mRNA发现，与EAE比较阿托伐他汀干预后TIM-3表达下降，TIM-1表达上升，提示其能通过减少Th1型反应减少EAE中枢神经系统炎症反应，并使之向Th2型反应转化，从而使EAE病情缓解，对EAE产生治疗作用。 综上所述，阿托伐他汀可能是一种有前景的多发性硬化治疗药物。
参考文献
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（收稿日期：2012-11-14） （本文编辑：王宇）