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摘要：为给“瓯雪60天”制种中核不育系母本9901A组培快繁提供依据，以9901A花球表面花枝为外植体，采用正交设计方法对培养基中TDZ、BA、NAA、2，4-D 4种激素浓度配比进行筛选。结果表明：MS+6-BA0.5mg/L +NAA0.001mg/L芽诱导率最大，为94%，但每外植体平均诱导芽数为1.1个；MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L每外植体平均诱导芽数最大，为10个，但芽诱导率为50%。TDZ和NAA浓度适中促进外植体平均芽数的诱导，过高则抑制外植体平均芽数的诱导；2，4-D 和6-BA总体表现为随浓度增加而抑制外植体平均芽数的诱导。
关键词：噻二唑苯基脲（TDZ）；花椰菜；诱导培养；正交设计
中图分类号 S63 文献标识码A文章编号1007-7731（2014）13-61-02
Application of Orthogonal Design in Multiple Shoots Induction of Cauliflower Male Sterile Lines
Liu Qing1，2 et al.
（1Wenzhou Academy of Agricultural Science，Wenzhou 325000，China；2Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325000，China）
Abstract：In order to provide a certain reference for rapid propagation of the female parent 9901A（genic male sterile lines） of "Ou xue 60 days"，concentrations of TDZ，BA，NAA，2，4-D on multiple shoots induction were screening by orthogonal design method.The results show that，the budding induction rate of MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L was the highest （94%） with budding induction number 1.1 per explants；and the budding induction number of MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L was the highest（10 per plant）with budding induction rate 50%.It was suggested that TDZ and NAA had a promoting effect on budding induction with moderate concentration.The effect of 2，4-D and 6-BA on budding induction was reduced as the concentration increased.
Key words：Thidiazuron；Cauliflower；Induction culture；Orthogonal design
花椰菜杂种优势明显，生产用种多为杂交种，主要通过自交不亲和系和雄性不育系来杂交制种。利用自交不亲和系制种成本高，杂交种纯度难以保障，而利用雄性不育系杂交制种成本低，种子纯度高。花椰菜“瓯雪60天”杂交制种母本9901A为隐性核基因控制的不育系，需应用植物组织培养技术才能短期内大量繁殖［1］。花椰菜组织培养中，培养基中的激素浓度的配比是关键。岳冬梅研究了6-BA、NAA、IBA的不同浓度配比对花椰菜丛生芽和生根诱导培养的影响［2］；吴丽芳等研究发现MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L的培养基上诱导花椰菜不育系不定芽分化率达到96%［3］；许端祥等研究发现了花椰菜自交不亲和系腋芽增殖培养基为MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L［4］。TDZ（噻二唑苯基脲）是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，在桑树［5］、大豆［6］等植物组织培养已有研究应用，但在花椰菜组织培养中的应用研究尚未见报道。本文报道了TDZ、6-BA、NAA、2，4-D对“瓯雪60天”母本9901A丛生芽诱导培养的影响，为9901A快速繁殖提供参考。
1 材料与方法
1.1 外植体 以“瓯雪60天”母本9901A采收期割球割下的花枝作为接种外植体。
1.2 培养基 MS基本培养基中按照L9（34）正交设计加入TDZ、6-BA、NAA、2，4-D作为诱导培养基（表1和表2）。所有培养基均为蔗糖3.0%，琼脂0.7%，pH值5.8。
表1 正交试验设计
[水平&A=TDZ
（mg/L）&B=2，4-D
（mg/L）&C=NAA
（mg/L）&D=6-BA
（mg/L）&1&0&0&0&0&2&0.1&0.01&0.001&0.5&3&1.0&0.1&0.01&5&]
1.3 诱导培养 取花球表面3mm厚花枝切成2～3mm小块，接种于上述诱导培养基中，每瓶接种5小块，然后置于培养室培养（温度24±2℃，每天光照12h）。接种时间2010年12月30日。
1.4 统计方法 接种50d后，统计芽诱导率和平均诱导芽数。芽诱导率（%）=诱导出芽的外植体数/接种的外植体数×100；平均诱导芽数（%）=诱导出的芽数/接种的外植体数×100。
2 结果与分析
2.1 不同浓度激素配比对花椰菜芽诱导率的影响 由表2可以看出，在设定的浓度水平上4种激素对花椰菜芽诱导率的影响，最主要的因素为因子A（TDZ浓度），极差最大，为16.0；其次是因子D（6-BA浓度），极差为15.4；再次是因子B（2，4-D浓度），极差为14.0；最次是因子C（NAA浓度），极差最小，为12.7。而各激素不同浓度水平的均值大小依此为：TDZ为0＞1.0＞0.1mg/L；2，4-D为0.1＞0.01＞0mg/L；NAA为0.01＞0＞0.001mg/L；6-BA为0.5＞5＞0mg/L。直观分析结果表明，花椰菜芽诱导率最佳条件是A1B1C3D2，即培养基配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L。
表2 芽诱导率L9（34）正交试验结果与直观分析
[试验号&A=TDZ（mg/L）&B=2，4-D
（mg/L）&C=NAA
（mg/L）&D=6-BA
（mg/L）&芽诱导率
（%）&1&1&1&3&2&94&2&1&2&1&1&82&3&1&3&2&3&86&4&2&1&2&1&50&5&2&2&3&3&76&6&2&3&1&2&88&7&3&1&1&3&76&8&3&2&3&2&84&9&3&3&2&1&88&k1&87.3&73.3&82&73.3&&k2&71.3&80.7&73.3&88.7&&k3&82.7&87.3&86&79.3&&R&16.0&14.0&12.7&15.4&&]
2.2 不同浓度激素配比对花椰菜平均诱导芽数的影响 由表3可以看出，在设定的浓度水平上，影响花椰菜平均诱导芽数最主要的因素为因子D（6-BA浓度），极差最大，为4.20；其次是因子A（TDZ浓度）和C（NAA浓度），极差均为2.93；最后是因子B（2，4-D浓度），极差为1.83。而各激素不同浓度水平的均值大小依此为：TDZ为0.1＞0＞1mg/L；2，4-D为0＞0.01＞0.1mg/L；NAA为0.001＞0＞0.01mg/L；6-BA为0＞5＞0.5mg/L。直观分析结果表明，花椰菜平均诱导芽数最佳条件是A2B1C2D1，即培养基配方为MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L。
表3 平均诱导芽数L9（34）正交试验结果与直观分析
[试验号&A=TDZ（mg/L）&B=2，4-D（mg/L）&C=NAA
（mg/L）&D=6-BA
（mg/L）&平均诱导芽数
（个/外植体）&1&1&1&3&2&1.1&2&1&2&1&1&4.9&3&1&3&2&3&2.3&4&2&1&2&1&10.0&5&2&2&3&3&1.3&6&2&3&1&2&2.3&7&3&1&1&3&1.3&8&3&2&3&2&1.2&9&3&3&2&1&2.3&k1&2.77&4.13&2.83&5.73&&k2&4.53&2.47&4.50&1.53&&k3&1.60&2.30&1.57&1.63&&R&2.93&1.83&2.93&4.20&&]
4 结论与讨论
应用正交设计可以大量减少试验次数，提高试验效率和结果的准确性，已经广泛用于植物组织培养研究［7］。本研究发现，在各激素所选的浓度范围内，对于花椰菜芽诱导率作用大小依此为TDZ＞6-BA＞2，4-D＞NAA；各激素不同浓度对芽诱导率的影响表现为：芽诱导率随着2，4-D的提高而提高，随着TDZ、NAA浓度的提高呈现先下降再上升，随着6-BA浓度的提高呈现先上升再下降。直观分析认为，MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高芽诱导率，为94%，但每外植体平均诱导芽数为1.1个。
本研究还发现，在各激素所选的浓度范围内，对于花椰菜平均诱导芽数的作用大小依次为6-BA＞TDZ= NAA＞2，4-D；其中TDZ和NAA浓度适中促进外植体平均芽数的诱导，过高则抑制外植体平均芽数的诱导；2，4-D和6-BA总体表现为随浓度增加而抑制外植体平均芽数的诱导。直观分析认为，MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高平均诱导芽数，每外植体平均诱导芽数为10个，但芽诱导率仅50%。
综上所述，通过正交设计优化筛选出芽诱导率最高的培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L，平均诱导芽数最高的培养基为MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L，两者并不一致。这是由于实验中丛生芽形成途径有经过愈伤组织分化和直接诱导形成2种途径，并且各激素不同浓度水平变化对愈伤组织诱导和丛生芽分化的影响效果也不一样，有待于进一步研究。
参考文献
［1］张小玲，唐征，刘庆，等.花椰菜雄性不育突变株的发现及利用［J］.核农学报，2012，26（3）：450-453.
［2］岳冬梅.花椰菜的组织快繁［J］.辽宁农业科学，2008，4：50.
［3］吴丽芳，蒋亚莲，张艺萍，等.花椰菜雄性不育系组织快繁及无糖培养技术［J］.北方园艺，2009（6）：57-58.
［4］许端祥，方淑桂，陈文辉.花椰菜自交不亲和系组培快繁技术研究［J］.福建农业科技，2006，5：32-34.
［5］黄艳红，牟志美，樊金会，等.噻二唑苯基脲对桑树愈伤组织诱导的影响［J］.蚕业科学，2006，32（1）：103-105.
［6］聂王星，於丙军.TDZ和6-BA对大豆子叶节再生体系中丛生芽诱导的效应［J］.南京农业大学学报，2012，35（4）：130-134.
［7］陈政，李程斌，何家宝，等.正交设计在驱蚊草组织培养中的应用［J］.安徽师范大学学报，2008，31（4）：364-367.
（责编：张宏民）
关键词：噻二唑苯基脲（TDZ）；花椰菜；诱导培养；正交设计
中图分类号 S63 文献标识码A文章编号1007-7731（2014）13-61-02
Application of Orthogonal Design in Multiple Shoots Induction of Cauliflower Male Sterile Lines
Liu Qing1，2 et al.
（1Wenzhou Academy of Agricultural Science，Wenzhou 325000，China；2Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325000，China）
Abstract：In order to provide a certain reference for rapid propagation of the female parent 9901A（genic male sterile lines） of "Ou xue 60 days"，concentrations of TDZ，BA，NAA，2，4-D on multiple shoots induction were screening by orthogonal design method.The results show that，the budding induction rate of MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L was the highest （94%） with budding induction number 1.1 per explants；and the budding induction number of MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L was the highest（10 per plant）with budding induction rate 50%.It was suggested that TDZ and NAA had a promoting effect on budding induction with moderate concentration.The effect of 2，4-D and 6-BA on budding induction was reduced as the concentration increased.
Key words：Thidiazuron；Cauliflower；Induction culture；Orthogonal design
花椰菜杂种优势明显，生产用种多为杂交种，主要通过自交不亲和系和雄性不育系来杂交制种。利用自交不亲和系制种成本高，杂交种纯度难以保障，而利用雄性不育系杂交制种成本低，种子纯度高。花椰菜“瓯雪60天”杂交制种母本9901A为隐性核基因控制的不育系，需应用植物组织培养技术才能短期内大量繁殖［1］。花椰菜组织培养中，培养基中的激素浓度的配比是关键。岳冬梅研究了6-BA、NAA、IBA的不同浓度配比对花椰菜丛生芽和生根诱导培养的影响［2］；吴丽芳等研究发现MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L的培养基上诱导花椰菜不育系不定芽分化率达到96%［3］；许端祥等研究发现了花椰菜自交不亲和系腋芽增殖培养基为MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L［4］。TDZ（噻二唑苯基脲）是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，在桑树［5］、大豆［6］等植物组织培养已有研究应用，但在花椰菜组织培养中的应用研究尚未见报道。本文报道了TDZ、6-BA、NAA、2，4-D对“瓯雪60天”母本9901A丛生芽诱导培养的影响，为9901A快速繁殖提供参考。
1 材料与方法
1.1 外植体 以“瓯雪60天”母本9901A采收期割球割下的花枝作为接种外植体。
1.2 培养基 MS基本培养基中按照L9（34）正交设计加入TDZ、6-BA、NAA、2，4-D作为诱导培养基（表1和表2）。所有培养基均为蔗糖3.0%，琼脂0.7%，pH值5.8。
表1 正交试验设计
[水平&A=TDZ
（mg/L）&B=2，4-D
（mg/L）&C=NAA
（mg/L）&D=6-BA
（mg/L）&1&0&0&0&0&2&0.1&0.01&0.001&0.5&3&1.0&0.1&0.01&5&]
1.3 诱导培养 取花球表面3mm厚花枝切成2～3mm小块，接种于上述诱导培养基中，每瓶接种5小块，然后置于培养室培养（温度24±2℃，每天光照12h）。接种时间2010年12月30日。
1.4 统计方法 接种50d后，统计芽诱导率和平均诱导芽数。芽诱导率（%）=诱导出芽的外植体数/接种的外植体数×100；平均诱导芽数（%）=诱导出的芽数/接种的外植体数×100。
2 结果与分析
2.1 不同浓度激素配比对花椰菜芽诱导率的影响 由表2可以看出，在设定的浓度水平上4种激素对花椰菜芽诱导率的影响，最主要的因素为因子A（TDZ浓度），极差最大，为16.0；其次是因子D（6-BA浓度），极差为15.4；再次是因子B（2，4-D浓度），极差为14.0；最次是因子C（NAA浓度），极差最小，为12.7。而各激素不同浓度水平的均值大小依此为：TDZ为0＞1.0＞0.1mg/L；2，4-D为0.1＞0.01＞0mg/L；NAA为0.01＞0＞0.001mg/L；6-BA为0.5＞5＞0mg/L。直观分析结果表明，花椰菜芽诱导率最佳条件是A1B1C3D2，即培养基配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L。
表2 芽诱导率L9（34）正交试验结果与直观分析
[试验号&A=TDZ（mg/L）&B=2，4-D
（mg/L）&C=NAA
（mg/L）&D=6-BA
（mg/L）&芽诱导率
（%）&1&1&1&3&2&94&2&1&2&1&1&82&3&1&3&2&3&86&4&2&1&2&1&50&5&2&2&3&3&76&6&2&3&1&2&88&7&3&1&1&3&76&8&3&2&3&2&84&9&3&3&2&1&88&k1&87.3&73.3&82&73.3&&k2&71.3&80.7&73.3&88.7&&k3&82.7&87.3&86&79.3&&R&16.0&14.0&12.7&15.4&&]
2.2 不同浓度激素配比对花椰菜平均诱导芽数的影响 由表3可以看出，在设定的浓度水平上，影响花椰菜平均诱导芽数最主要的因素为因子D（6-BA浓度），极差最大，为4.20；其次是因子A（TDZ浓度）和C（NAA浓度），极差均为2.93；最后是因子B（2，4-D浓度），极差为1.83。而各激素不同浓度水平的均值大小依此为：TDZ为0.1＞0＞1mg/L；2，4-D为0＞0.01＞0.1mg/L；NAA为0.001＞0＞0.01mg/L；6-BA为0＞5＞0.5mg/L。直观分析结果表明，花椰菜平均诱导芽数最佳条件是A2B1C2D1，即培养基配方为MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L。
表3 平均诱导芽数L9（34）正交试验结果与直观分析
[试验号&A=TDZ（mg/L）&B=2，4-D（mg/L）&C=NAA
（mg/L）&D=6-BA
（mg/L）&平均诱导芽数
（个/外植体）&1&1&1&3&2&1.1&2&1&2&1&1&4.9&3&1&3&2&3&2.3&4&2&1&2&1&10.0&5&2&2&3&3&1.3&6&2&3&1&2&2.3&7&3&1&1&3&1.3&8&3&2&3&2&1.2&9&3&3&2&1&2.3&k1&2.77&4.13&2.83&5.73&&k2&4.53&2.47&4.50&1.53&&k3&1.60&2.30&1.57&1.63&&R&2.93&1.83&2.93&4.20&&]
4 结论与讨论
应用正交设计可以大量减少试验次数，提高试验效率和结果的准确性，已经广泛用于植物组织培养研究［7］。本研究发现，在各激素所选的浓度范围内，对于花椰菜芽诱导率作用大小依此为TDZ＞6-BA＞2，4-D＞NAA；各激素不同浓度对芽诱导率的影响表现为：芽诱导率随着2，4-D的提高而提高，随着TDZ、NAA浓度的提高呈现先下降再上升，随着6-BA浓度的提高呈现先上升再下降。直观分析认为，MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高芽诱导率，为94%，但每外植体平均诱导芽数为1.1个。
本研究还发现，在各激素所选的浓度范围内，对于花椰菜平均诱导芽数的作用大小依次为6-BA＞TDZ= NAA＞2，4-D；其中TDZ和NAA浓度适中促进外植体平均芽数的诱导，过高则抑制外植体平均芽数的诱导；2，4-D和6-BA总体表现为随浓度增加而抑制外植体平均芽数的诱导。直观分析认为，MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L有利于提高平均诱导芽数，每外植体平均诱导芽数为10个，但芽诱导率仅50%。
综上所述，通过正交设计优化筛选出芽诱导率最高的培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.001mg/L，平均诱导芽数最高的培养基为MS+TDZ0.1mg/L+NAA0.001mg/L，两者并不一致。这是由于实验中丛生芽形成途径有经过愈伤组织分化和直接诱导形成2种途径，并且各激素不同浓度水平变化对愈伤组织诱导和丛生芽分化的影响效果也不一样，有待于进一步研究。
参考文献
［1］张小玲，唐征，刘庆，等.花椰菜雄性不育突变株的发现及利用［J］.核农学报，2012，26（3）：450-453.
［2］岳冬梅.花椰菜的组织快繁［J］.辽宁农业科学，2008，4：50.
［3］吴丽芳，蒋亚莲，张艺萍，等.花椰菜雄性不育系组织快繁及无糖培养技术［J］.北方园艺，2009（6）：57-58.
［4］许端祥，方淑桂，陈文辉.花椰菜自交不亲和系组培快繁技术研究［J］.福建农业科技，2006，5：32-34.
［5］黄艳红，牟志美，樊金会，等.噻二唑苯基脲对桑树愈伤组织诱导的影响［J］.蚕业科学，2006，32（1）：103-105.
［6］聂王星，於丙军.TDZ和6-BA对大豆子叶节再生体系中丛生芽诱导的效应［J］.南京农业大学学报，2012，35（4）：130-134.
［7］陈政，李程斌，何家宝，等.正交设计在驱蚊草组织培养中的应用［J］.安徽师范大学学报，2008，31（4）：364-367.
（责编：张宏民）