【摘 要】
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目的 以双拷贝HBV全基因质粒pEcob6转染非癌性肝源细胞株L02细胞建立有HBV分泌的细胞转染模型,通过检测细胞表面HLA-A,B,C及MHC Ⅰ类链相关基因(MIC)A/B分子,分析HBV对肝细胞
【机 构】
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重庆医科大学病毒性肝炎研究所、教育部省部共建感染性疾病分子生物学重点实验室
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目的 以双拷贝HBV全基因质粒pEcob6转染非癌性肝源细胞株L02细胞建立有HBV分泌的细胞转染模型,通过检测细胞表面HLA-A,B,C及MHC Ⅰ类链相关基因(MIC)A/B分子,分析HBV对肝细胞HLA-A,B,C和MICA/B表达的影响.方法 用EcoR Ⅰ酶切掉pEcob6的HBV基因并连接,构建无HBV基因的对照空质粒;用脂质体法以pEcob6或空质粒与pcDNA3.1-neo共转染L02细胞株,筛选抗性细胞株并稳定传代;用Abbott EIA试剂和免疫荧光法检测细胞上清液和(或)细胞的HBsAg、HBcAg和HBeAg表达,实时荧光定量PCR检测HBV DNA含量;用流式细胞仪检测细胞表面HLA-A,B,C和MICA/B分子的表达,分析两种分子表达的变化.结果 经G418抗性克隆筛选,pEcob6稳定转染细胞株(L02-HBV)的上清液HBsAg和HBeAg可达24.78(S/N)和4.117(S/N),HBV DNA为9.67×104拷贝/ml;而对照空质粒转染细胞株(L02-mock)和L02的表达均为阴性.共聚焦显微镜观察,L02-HBV细胞内的HBsAg强表达于细胞质内,而HBcAg弱表达于胞核或胞质内.流式细胞检测结果显示,L02和L02-mock细胞有HLA-A,B,C的表达,基本无MICA/B的表达,L02-HBV细胞HLA-A,B,C和MICA/B的表达均增强,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 以HBV全基因质粒转染L02细胞经筛选、克隆、传代,可获得有HBV相关抗原表达及HBV DNA分泌的细胞模型.HBV基因的转录或复制可增强肝细胞株L02的HLA-A,B,C及MICA/B的表达,可能与肝细胞的免疫损伤有关.
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